一、 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
表格一：實(shí)驗(yàn)儀器
儀器
廠家
型號(hào)
細(xì)胞培養(yǎng)箱
thermo scientific
hera cell co2
低溫高速離心機(jī)
64r
beckman
流式細(xì)胞儀
bd
facs calibur
表格二：試劑
試劑
廠家
dmem 培養(yǎng)液
hyclone
pi
sigma
pbs 7.4 (0.1 m)
自配
乙醇
國(guó)藥集團(tuán)
rna 酶
sigma
二、 實(shí)驗(yàn)步驟
細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生*的 a172 細(xì)胞，按 1*105個(gè)/ml 以 1ml 體積接種于 6 孔板內(nèi)。無(wú)抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜,到轉(zhuǎn)染時(shí)使細(xì)胞達(dá)到 70％的匯合率。
轉(zhuǎn)染
將 12.5ul sirna 溶于 387.5ul 無(wú)血清的 dmem 中,混合均勻。
將 12.5ul lipofectamine 2000 溶于 387.5ul 無(wú)血清的 dmem 中，混合均
勻。在室溫下孵育 5 分鐘。
將上述兩種混合物混合（總體積 800ul）,輕輕混合均勻在室溫下孵育
20 分鐘形成復(fù)合物。
在 6 孔板中每孔加入 800ul 復(fù)合物。十字法混合均勻。
細(xì)胞在 37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6h 后棄上清液,并加入 10％胎牛血
清的 dmem 培養(yǎng)液。
固定
培養(yǎng) 48h 后小心吸去上清，*消化并離心收集細(xì)胞（1000rpm/min），棄上清，用預(yù)冷 pbs 洗細(xì)胞 2 次，加入預(yù)冷 70％乙醇， -20℃固定保存。
染色
離心，棄上清；
1ml pbs 洗 1 次，離心；
加入 10ul rnase a（20ug/ml）于 500ul pbs, 37 度 30min 孵育后，離心；
pbs 洗 1 次，離心；
加 10ul pi (50 ug/ml)于 500 ul pbs，室溫避光 30min。
檢測(cè)
以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，汞激發(fā)波長(zhǎng) 488nm，計(jì)數(shù) 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，結(jié)果
使用 modfit 軟件分析。
三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
省略