pcr引物設(shè)計八點決竅
（1）引物長度
引物長度對反應(yīng)特異性、解鏈溫度、退火時間都有較大的影響，zui終影響到 pcr 反應(yīng)是否成功。多數(shù)情況下，引物長度約 18~30bp, 引物太短會導(dǎo)致非特異擴增，太長雖然會增加特異性，但是二級結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)）出現(xiàn)的概率增大。
（2）引物的解鏈溫度
pcr 反應(yīng)的特異性很大程度上依賴于引物的解鏈溫度（tm 值）。多數(shù) pcr 反應(yīng)*的 解鏈溫度應(yīng)在 55~60℃，如果沒有其他不穩(wěn)定因素，引物的 tm 值取決于它的長度、序列組成和濃度，離子強度的影響可以忽略不計，因為不同的 pcr 反應(yīng)鹽濃度變化不大。
一個反應(yīng)中所有引物的解鏈溫度應(yīng)盡可能接近。對于多數(shù) pcr 反應(yīng)而言，引物之間的差應(yīng)小于 2~3℃。差值增大，反應(yīng)效率會降低，甚至直接導(dǎo)致反應(yīng)失敗。因為 tm 值髙 的引物在低于退火溫度的條件下錯配，而 tm 值低的引物在髙于退火溫度的條件下與模板只有低濃度結(jié)合。
可利用以zui近鄰熱力學(xué)理論為基礎(chǔ)的公式估算 tm 值，該理論分析了復(fù)式解鏈的熱力學(xué)過程。
tm = [△h/△s-rin(c)]-273.15（公式 1）
復(fù)式構(gòu)成物中焓變（△h）和熵變（△s ）可借助于zui近鄰熱力學(xué)參數(shù)計算，為摩爾氣體常數(shù)，c 為寡核苷酸的物質(zhì)的量濃度。該分析可確定特定的焓和熵對復(fù)式構(gòu)成物的自由能 的影響，該影響由序列中的「zui近鄰」造成。zui近鄰從 5 末端起始，焓和熵的效應(yīng)是加性的。在式（1）中加人另一個條件，以經(jīng)驗性地計算鹽對復(fù)式構(gòu)成物的穩(wěn)定性的影響。