幾種常見(jiàn)的拉曼技術(shù)
共振拉曼(rrs)
如果激光的波長(zhǎng)和分子的電子吸收相吻合,這一分子的某個(gè)或幾個(gè)特征拉曼譜帶強(qiáng)度將增至100-10,000 倍以上,并觀察到正常拉曼效應(yīng)中難以出現(xiàn)的、其強(qiáng)度可與基頻相比擬的泛音及組合振動(dòng)光譜。這種共振增強(qiáng)或共振拉曼效應(yīng)非常有用,不僅能顯著降低檢測(cè)限,而且可引入電子選擇性。由于共振拉曼能提供結(jié)構(gòu)及電子等信息,因此,共振拉曼也被用于物質(zhì)鑒定。
紫外共振拉曼(uvrrs)
熒光干擾問(wèn)題和靈敏度較低嚴(yán)重阻礙了常規(guī)拉曼光譜的廣泛應(yīng)用。但近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的紫外拉曼光譜技術(shù)有效地解決了上述問(wèn)題。紫外拉曼光譜技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展大大地?cái)U(kuò)展了拉曼光譜的應(yīng)用范圍。右圖是紫外拉曼光譜避開(kāi)熒光干擾的原理圖。熒光往往出現(xiàn)在300 nm-700 nm 區(qū)域,或者更長(zhǎng)波長(zhǎng)區(qū)域。而在紫外區(qū)的某個(gè)波長(zhǎng)以下,熒光極少出現(xiàn)。因此,對(duì)于許多在可見(jiàn)拉曼光譜中存在強(qiáng)熒光干擾的物質(zhì),例如氧化物、積碳等, 通過(guò)利用紫外拉曼光譜技術(shù)就可以成功的避開(kāi)熒光從而得到信噪比較高的拉曼譜圖。從下圖磷酸鋁分子篩alpo-5 示例可以看出,紫外共振拉曼光譜技術(shù)由于能避開(kāi)熒光,可以成功用于微孔和介孔分子篩材料的表征。
紫外拉曼光譜技術(shù)的另一個(gè)突出特點(diǎn)是,拉曼信號(hào)可以通過(guò)共振拉曼信號(hào)得到增強(qiáng)。共振拉曼效應(yīng)可以從拉曼散射截面公式得到解釋?zhuān)焊鶕?jù)kramers-heisenberg-dirac 散射公式:
在公式 (1) 中,ωri 是初始態(tài)i 到激發(fā)態(tài)r 的能量差頻率,ωl 是入射激光頻率。當(dāng)激發(fā)光源頻率靠近電子吸收帶時(shí),*項(xiàng)分母趨近于零,因而其散射截面異常增大, 導(dǎo)致某些特定的拉曼散射強(qiáng)度增加104~106 倍。共振拉曼光譜的譜峰強(qiáng)度隨著激發(fā)線(xiàn)的不同而呈現(xiàn)出與普通拉曼不同的變化。
紫外拉曼光譜規(guī)避熒光成功表征aipo-5 分子篩的信號(hào)
將紫外共振拉曼用于表征多組份體系時(shí),可以選擇性的激發(fā)某些組分相應(yīng)的信息,從而使與這些組分相關(guān)的拉曼信號(hào)大大增強(qiáng),得到共振拉曼光譜
這種共振增強(qiáng)或者共振拉曼效應(yīng)是非常有用的一個(gè)技術(shù),它不僅可以極大的降低拉曼測(cè)量的探測(cè)極限,而且還可以引入到電子選擇上面。這樣,如果我們使用共振拉曼技術(shù)來(lái)研究樣品,不僅可以看到它的結(jié)構(gòu)特征,而且還可以得到它的電子結(jié)構(gòu)信息。金屬卟啉, 類(lèi)胡蘿卜素以及其他一系列生物重要分子的電子能級(jí)之間躍遷能量差都處在可見(jiàn)光范圍之內(nèi),這使得它們成了共振拉曼光譜的理想研究材料。
拉曼散射和共振拉曼散射的能級(jí)圖以及它們對(duì)應(yīng)拉曼譜圖示意圖
共振選擇技術(shù)還有一個(gè)非常實(shí)際的應(yīng)用。那就是二分之一載色體的光譜由于這種共振作用會(huì)得到增強(qiáng),而它周?chē)沫h(huán)境則不會(huì)。對(duì)于生物染色體來(lái)說(shuō)這就意味著,我們使用可見(jiàn)光即可特定的探測(cè)到有源吸收中心,而它們周?chē)牡鞍踪|(zhì)陣列則不會(huì)對(duì)探測(cè)產(chǎn)生影響(這是因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)需要紫外光才能使其產(chǎn)生共振增強(qiáng)作用)。共振拉曼光譜在化學(xué)上探測(cè)金屬中心合成物,富勒分子,聯(lián)乙醯以及其他的稀有分子上也是一種重要的技術(shù),因?yàn)檫@些材料對(duì)于可見(jiàn)光都有著很強(qiáng)的吸收。
其他更多的分子吸收光譜由于處于紫外,所以需要紫外激光進(jìn)行共振激發(fā),我們就稱(chēng)之為紫外共振拉曼(ultra violet resonance raman spectroscopy); 紫外共振拉曼光譜技術(shù)是研究催化和復(fù)雜生物系統(tǒng)中分子分析的一個(gè)重要工具。大多數(shù)的生物系統(tǒng)都吸收紫外輻射, 所以它們都能提供紫外的共振拉曼增強(qiáng)。這樣高的共振拉曼共振選擇效應(yīng)使得像蛋白質(zhì)和dna 等重要生物目標(biāo)的拉曼光譜得到極大增強(qiáng), 而其他物質(zhì)則不會(huì),非常便于目標(biāo)確認(rèn)及分析。例如,200nm 的激發(fā)光能夠增強(qiáng)氨基化合物的振動(dòng)峰;而220nm 的激發(fā)光則可以增強(qiáng)特定的芳香族殘留物的振動(dòng)峰。水中的拉曼散射非常弱,這個(gè)技術(shù)使得與水有關(guān)的微弱系統(tǒng)的拉曼分析也變成了可能。
金屬卟啉、類(lèi)胡蘿卜素以及其他幾類(lèi)重要的生物分子在可見(jiàn)光區(qū)域內(nèi)有強(qiáng)烈的電子躍遷,因此他們成了理想的共振拉曼光譜檢測(cè)對(duì)象。
表面增強(qiáng)拉曼(sers)
自1974 年fleischmann 等人發(fā)現(xiàn)吸附在粗糙化的ag 電極表現(xiàn)的吡啶分子具有巨大的拉曼散射現(xiàn)象,加之活性載體表面選擇吸附分子對(duì)熒光發(fā)射的抑制,激光拉曼光譜分析的信噪比大大提高,這種表面增強(qiáng)效應(yīng)被稱(chēng)為表面增強(qiáng)拉曼散射(sers)。
拉曼散射由化合物(或離子)的散射吸附,或在結(jié)構(gòu)化金屬表面,可達(dá)到溶液中散射的103 倍到106 倍。這種表面增強(qiáng)拉曼散射在銀表面表現(xiàn)得zui強(qiáng),在金或銅表面也比較強(qiáng)。其他金屬則沒(méi)有這么強(qiáng)的增強(qiáng)效應(yīng)。
表面增強(qiáng)效應(yīng)產(chǎn)生的兩個(gè)機(jī)制:
*種是在貴金屬表面產(chǎn)生一種增強(qiáng)的電磁場(chǎng)。當(dāng)入射光的波長(zhǎng)接近金屬等離子體波長(zhǎng)時(shí),金屬表面?zhèn)鲗?dǎo)電子被激發(fā)到一個(gè)擴(kuò)展表面的電子激發(fā)態(tài),稱(chēng)為表面等離子體共振。分子吸附在表面或接近表面經(jīng)過(guò)一個(gè)異常大的電磁場(chǎng)。垂直于表面的振動(dòng)模式帶來(lái)的增強(qiáng)zui強(qiáng)烈。
第二種是是在表面和分析物分子之間形成電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物。許多電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物帶來(lái)的電子躍遷會(huì)產(chǎn)生可見(jiàn)光,以便發(fā)生增強(qiáng)諧振。
顯微共聚焦拉曼(confocal)
共焦:從一個(gè)點(diǎn)光源發(fā)射的探測(cè)光通過(guò)透鏡聚焦到被觀測(cè)物體上,如果物體恰在焦點(diǎn)上,那么反射光通過(guò)原透鏡應(yīng)當(dāng)匯聚回到光源, 這就是所謂的共聚焦,簡(jiǎn)稱(chēng)共焦。共焦指的是空間濾波的能力和控制被分析樣品的體積的能力,通常是利用顯微鏡系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。只有顯微鏡系統(tǒng)的無(wú)限遠(yuǎn)光路才可以實(shí)現(xiàn)良好的共焦性能。
顯微拉曼光譜技術(shù)是將拉曼光譜分析技術(shù)與顯微分析技術(shù)結(jié)合起來(lái)的一種應(yīng)用技術(shù)。與其他傳統(tǒng)技術(shù)相比,更易于直接獲得大量有價(jià)值信息,共聚焦顯微拉曼光譜不僅具有常規(guī)拉曼光譜的特點(diǎn),還有自己的*優(yōu)勢(shì),樣品區(qū)接近衍射極限(約1 微米);成像和光譜可以被組合以產(chǎn)生“拉曼立方體”三維數(shù)據(jù),在二維圖像的每個(gè)像素對(duì)應(yīng)一個(gè)拉曼頻譜信息。
從光學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō),顯微共聚焦拉曼光譜儀主要有針孔共聚焦和“狹縫-ccd”共聚焦兩種設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)。
先進(jìn)的“狹縫+ccd 焦平面共焦”技術(shù),具有較高通光效率,高靈敏度,操作簡(jiǎn)單。
原理:顯微鏡頭聚焦到樣品上,將顯微鏡頭收集的樣品信號(hào)聚焦到光譜儀狹縫入口,通過(guò)狹縫對(duì)焦平面的一維(x 方向)限制進(jìn)入光譜儀; 經(jīng)光譜儀分光,光譜成像在ccd 上;在通過(guò)對(duì)ccd 上像元的提取, 對(duì)另一維(y 方向)的信號(hào)的限制,提取出樣品上的信號(hào),實(shí)現(xiàn)共焦作用。“狹縫+ccd 焦平面共焦”技術(shù)特點(diǎn):
1、 共焦區(qū)域任意設(shè)置(狹縫寬度,ccd 像元區(qū)域任意設(shè)定)。
2、 全部信號(hào)進(jìn)入光譜儀,沒(méi)有信號(hào)損失。
采用“狹縫+ccd焦平面共焦”技術(shù)的finder vista(“微曼”共聚焦拉曼顯微鏡)空間分辨率指標(biāo):
x,y方向空間分辨率:1um
z方向空間分辨:2um