1、范圍：適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測(cè)。
2 定義
2.1 回復(fù)突變 reversemutation
細(xì)菌在化學(xué)致突變物作用下由營(yíng)養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。
2.2 基因突變 gene mutation
在化學(xué)致突變物作用下細(xì)胞dna中堿基對(duì)的排列順序發(fā)生變化。
2.3 堿基置換突變 base substitutionmutation
引起dna鏈上一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的置換。
堿基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。
轉(zhuǎn)換是dna鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個(gè)嘌呤被另一嘌呤所代替。
顛換是dna鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個(gè)嘌呤被另一嘧啶所代替。
2.4 移碼突變 frameshiftmutation
引起dna鏈上增加或缺失一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)。
2.5 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)bacterial reverse mutation assay
利用一組*或者*缺陷型試驗(yàn)菌株測(cè)定引起細(xì)菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的氨基酸缺陷型→原養(yǎng)型回復(fù)突變的試驗(yàn)方法。
2.6 s9
經(jīng)多氯聯(lián)苯(pcb混合物)或c12h12n2o3鈉和β-萘黃酮結(jié)合誘導(dǎo)的大鼠制備肝勻漿，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。
3 原理
鼠傷寒沙門氏*營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成*，故在缺乏*的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)；大腸桿菌*營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成*，故在缺乏*的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)。假如有致突變物存在，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長(zhǎng)形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。
某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變，故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的s9混合液。
4 儀器和設(shè)備
電熱恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱（－80℃）或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計(jì)數(shù)器、低溫高速離心機(jī)，玻璃器皿、生物安全柜等。
5 培養(yǎng)基和試劑
5.1 0.5mmol/l*－0.5mmol/l*－0.5mmol/l*溶液
成分：
l-*（mw155）
78mg
d-*（mw244）
122mg
l-*（mw204）
102mg
加蒸餾水/去離子水至
1000ml
配制：將上述成分加熱，以溶解*，然后在0.068mpa下高壓滅菌20min。貯于4℃冰箱。若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加*。
5.2 頂層瓊脂培養(yǎng)基
成分：
瓊脂粉
1.2g
氯化鈉
1.0g
加蒸餾水/去離子水至
200ml
配制：上述成分混合后，于0.103mpa下高壓滅菌30min。實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入0.5mmol/l*－0.5mmol/l*－0.5mmol/l*溶液20ml。若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加*。
5.3 vogel-bonner(v-b)培養(yǎng)基e
成分：
枸櫞酸(c6h8o7·h2o)
100g
*(k2hpo4)
500g
磷酸氫銨鈉(nanh4hpo4·4h2o)
175g
*(mgso4·7h2o)
10g
加蒸餾水/去離子水至
1000ml
配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的*緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水/去離子水至1000ml。于0.103mpa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰箱。
5.4 20%葡萄糖溶液
成分：
葡萄糖
200g
加蒸餾水/去離子水至
1000ml
配制：加少量蒸餾水/去離子水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水/去離子水至1000ml。于0.068mpa下高壓滅菌20min。儲(chǔ)于4℃冰箱。
5.5 底層瓊脂培養(yǎng)基
成分：
瓊脂粉
7.5g
蒸餾水/去離子水
480ml
v-b培養(yǎng)基e
10ml
20%葡萄糖溶液
10ml
配制：首先將前兩種成分于0.103mpa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25ml制備平板，冷凝固化后倒置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中24h，備用。
5.6 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基
成分：
:c8h9cl
2.5g
胰胨
5.0g
*(k2hpo4)
1.0g
加蒸餾水/去離子水至
500ml
配制：將上述成分混合后，于0.103mpa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰箱。
5.7 鹽溶液(1.65mol/lkcl+0.4mol/lmgcl2)
成分：
(kcl)
61.5g
kcl
氯化鎂(mgcl2·6h2o)
40.7g
加蒸餾水/去離子水至
500ml
配制：在水中溶解上述成分后，于0.103mpa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰箱。
5.8 0.2mol/l磷酸鹽緩沖液(ph7.4)
成分：
*(nah2po4·2h2o)
2.965g
*(na2hpo4·12h2o)
29.015g
加蒸餾水/去離子水至
500ml
配制：溶解上述成分后，于0.103mpa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰箱。
5.9 s9混合液
成分：
每毫升s9混合液
肝s9
100μl
鹽溶液
20μl
滅菌蒸餾水/去離子水
380μl
0.2mol/l磷酸鹽緩沖液
500μl
輔酶ii(nadp)
4μmol
6-磷酸葡萄糖(g-6-p)
5μmol
配制：將輔酶ii和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶?jī)?nèi)稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分，使肝s9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，剩余s9混合液應(yīng)該丟棄。
5.10 菌株鑒定用和特殊用途試劑
5.10.1 *-*-*平板
成分：
瓊脂粉
15g
蒸餾水/去離子水
934ml
(v-b)培養(yǎng)基e
20ml
20%葡萄糖
20ml
滅菌鹽酸*水溶液(0.5g/100ml)
10ml
滅菌鹽酸*水溶液(0.5g/100ml)
10ml
滅菌0.5mmol/l*溶液
6ml
配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖，v-b培養(yǎng)基、*溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加*，同時(shí)蒸餾水/去離子水改為944ml）。待溶液稍微冷卻后，加入滅菌*，混勻，澆制平板。
5.10.2 氨芐*平板和氨芐*/四環(huán)素平板
成分：
瓊脂粉
15g
蒸餾水/去離子水
930ml
(v-b)鹽溶液
20ml
20%葡萄糖
20ml
滅菌鹽酸*溶液（0.5g/100ml）
10ml
滅菌鹽酸*水溶液(0.5g/100ml)
10ml
滅菌0.5mmol/l*溶液
6ml
氨芐*溶液(8mg/ml于0.02mol/l naoh中)
3.15ml
四環(huán)素溶液(8mg/ml于0.02mol/lhcl中)
0.25ml
配制：瓊脂和水高壓滅菌20min，將無(wú)菌的葡萄糖、vb鹽溶液、*溶液和*溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中，混勻（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加*，同時(shí)蒸餾水/去離子水改為加940ml）。冷卻至大約50℃，無(wú)菌條件下加入四環(huán)素溶液和/或氨芐*溶液。
應(yīng)該在傾注瓊脂平板后幾天內(nèi)，制備主平板。
5.10.3 營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板
成分：
瓊脂粉
7.5g
營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基
500ml
配制：于0.103mpa下高壓滅菌30min后傾注平板。
6 試驗(yàn)菌株及其生物學(xué)特性鑒定
6.1 試驗(yàn)菌株
采用以下菌株作為標(biāo)準(zhǔn)組合：
鼠傷*ta1535；
鼠傷*ta97或ta97a或ta1537；
鼠傷*ta98；
鼠傷*ta100；
鼠傷*ta102或大腸桿菌wp2uvra或大腸桿菌wp2uvra（pkm101）；
6.2 生物學(xué)特性鑒定
新獲得的或*保存的菌種，在試驗(yàn)前必須進(jìn)行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示。
表1 試驗(yàn)菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)
菌株
*缺陷
*缺陷
脂多糖屏障缺損
氨芐*抗性
切除修復(fù)缺損
四環(huán)素
抗性
自發(fā)回變菌落參考數(shù)*
ames實(shí)驗(yàn)室
zeiger實(shí)驗(yàn)室
ta97
+
/
+
+
+
-
90~180*
75~200*
ta97a
+
/
+
+
+
-
90~180*
75~200*
ta98
+
/
+
+
+
-
30~50
20~50
ta100
+
/
+
+
+
-
100~200
75~200
ta102
+
/
+
+
-
+
240~320*
100~400*
ta1535
+
/
+
-
+
-
10~35
5~20
ta1537
+
/
+
-
+
-
3~15
5~20
wp2uvra
/
+
/
-
+
-
/
5~20
wp2uvra（pkm101）
/
+
/
+
+
-
/
100~200
注
“+”表示需要*
“+”表示需要*
“+”表示具有rfa突變
“+”表示具有r因子
“+”表示對(duì)于鼠傷*具有△uvrb突變，對(duì)于大腸桿菌，具有△uvra突變
“+”表示具有paq1質(zhì)粒
*在體外代謝活化條件下自發(fā)回變菌
落數(shù)略增。
對(duì)于各菌的自發(fā)回變范圍，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室在參考其他實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上應(yīng)建立自己的歷史對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)，形成適合本實(shí)驗(yàn)室條件的適用范圍。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室背景數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)與文獻(xiàn)報(bào)道相符。
6.2.1 *缺陷/*缺陷
原理：*缺陷型試驗(yàn)菌株本身不能合成*，只能在補(bǔ)充*的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在缺乏*的培養(yǎng)基上，則不能生長(zhǎng)。
*缺陷試驗(yàn)菌株本身不能合成*，只能在補(bǔ)充*的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在缺乏*的培養(yǎng)基上，則不能生長(zhǎng)。
鑒定方法：將測(cè)試菌株增菌液分別于含*或者*培養(yǎng)基平板和無(wú)*或者*平板上劃線，于37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：*缺陷型菌株在含*平板上生長(zhǎng)，而在無(wú)*平板上則不能生長(zhǎng)；*缺陷型菌株在含*平板上生長(zhǎng)，而在無(wú)*平板上則不能生長(zhǎng)。
6.2.2 脂多糖屏障缺損
原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障缺損，因此一些大分子物質(zhì),如結(jié)晶紫能穿透菌膜進(jìn)入菌體，從而抑制其生長(zhǎng)，而野生型菌株則不受其影響。
鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液0.1ml于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線，然后將浸濕的0.1%結(jié)晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放置。37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：假若待測(cè)菌在濾紙條與劃線交叉處出現(xiàn)一透明菌帶，說(shuō)明該待測(cè)菌株具有rfa突變。
6.2.3 氨芐*抗性
原理：含r因子的試驗(yàn)菌株對(duì)氨芐*有抗性。因?yàn)閞因子不太穩(wěn)定，容易丟失，故用氨芐*確定該質(zhì)粒存在與否。
鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液0.1ml，在氨芐*平板上劃線，37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷；假若測(cè)試菌在氨芐*平板上生長(zhǎng)，說(shuō)明該測(cè)試菌具有抗氨芐*作用，表示含r因子，否則，表示測(cè)試菌不含r因子或r因子丟失。
6.2.4 紫外線敏感性
原理：具有△uvrb/a突變的菌株對(duì)紫外線敏感，當(dāng)受到紫外線照射后，不能生長(zhǎng)，而具有野生型切除修復(fù)酶的菌株，則能照常生長(zhǎng)。
鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液0.1ml于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（15w，距離33cm）8秒鐘。置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：具有△uvrb/a突變的菌株對(duì)紫外線敏感，經(jīng)輻射后細(xì)菌不生長(zhǎng)，而具有完整地切除修復(fù)系統(tǒng)的菌株，則照常生長(zhǎng)。
6.2.5 四環(huán)素抗性
原理：具有paqi的菌株對(duì)四環(huán)素有抗性。
鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液0.1ml于氨芐*/四環(huán)素平板上劃線，置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：假若測(cè)試菌照常在氨芐*/四環(huán)素平板上生長(zhǎng)，表明該測(cè)試菌株對(duì)氨芐*和四環(huán)素兩者有抗性，具有paqi質(zhì)粒，否則，說(shuō)明測(cè)試菌株不含paqi質(zhì)粒。
6.2.6 自發(fā)回變
原理：每種試驗(yàn)菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變，稱為自發(fā)回變。這種自發(fā)回變是每種試驗(yàn)菌株的一項(xiàng)特性。
鑒定方法：將待測(cè)菌株增菌液0.1ml加到2ml含*-*-*的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內(nèi)（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加*），混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待瓊脂固化后，置37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中孵育48—72h后記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。
結(jié)果判斷：每種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應(yīng)符合表1要求。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù)，要比直接作用下的略高。
6.2.7 回變特性-診斷性試驗(yàn)
原理：每種試驗(yàn)菌株對(duì)診斷性誘變劑回變作用的性質(zhì)以及s9混合液的效應(yīng)不一。
鑒定方法：按照平板摻入試驗(yàn)的操作步驟進(jìn)行。將受試物換成診斷性誘變劑。
結(jié)果判斷：標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)某些診斷性誘變劑*的回變結(jié)果參見表2。
表2 測(cè)試菌株的回變性
誘變劑
劑量(μg/皿)
s9
ta97
ta98
ta100
ta102
ta1535
ta1537
wp2uvra
wp2uvra（pkm101）
柔毛霉素
6.0
-
124
3123
47
592
/
/
/
/
n3na
1.5
-
76
3
3000
188
320(0.5μg)
/
/
/
icr-191
1.0
-
1640
63
185
0
/
/
/
/
鏈霉黑素
0.25
-
inh
inh
inh
2230
/
/
/
/
mitomycinc
0.5
-
inh
inh
inh
2772
/
/
/
/
2,4,7-三硝基-9-芴酮
0.20
-
8377
8244
400
16
/
/
/
/
4-硝基-o-次苯二胺
20
-
2160
1599
798
0
/
/
/
/
4-硝基喹啉-n-氧化物
0.5
-
528
292
4220
287
/
/
610
/
甲基磺酸甲酯
1.0(μl)
-
174
23
2730
6586
/
/
/
/
c8h10n3nao3s
50.0
-
2688
1198
183
895
/
/
/
/
9-氨基吖啶
50
-
/
/
/
/
/
337
/
/
2-氨基芴
10
+
1742
6194
3026
261
/
/
/
/
苯并（a）芘
1.0
+
337
143
937
255
/
110(5μg)
/
/
2-氨基蒽
20
+
/
/
/
/
380(5μg)
/
300
/
注：inh表示抑菌。
7 大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和s9的制備
7.1 誘導(dǎo)
選擇健康雄性成年大鼠，體重200g左右。將多氯聯(lián)苯（pcb混合物）溶于玉米油中，濃度為200mg/ml，按500mg/kg體重一次腹腔注射，5d后處死動(dòng)物，處死前禁食12h。
也可采用c12h12n2o3鈉和β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)的方法進(jìn)行制備。經(jīng)口或腹腔注射給予80mg/kgc12h12n2o3鈉和80mg/kg β-萘黃酮，連續(xù)3天，處死前禁食16h。
7.2 s9制備
首先，用75%酒精消毒動(dòng)物皮毛，剖開腹部。在無(wú)菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結(jié)締組織，用冰浴的0.15mol/lkcl溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/lkcl溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/lkcl溶液3ml。用電動(dòng)勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機(jī)上，在4℃條件下，以9000g離心10min，取其上清液（s9）分裝于塑料管中。每管裝2ml—3ml。儲(chǔ)存于液氮生物容器中或－80℃冰箱中備用。
上述全部操作均在冰水浴中和無(wú)菌條件下進(jìn)行。制備肝s9所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。s9制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進(jìn)行鑒定。
8 溶劑的選擇
如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸餾水/去離子水作為溶劑；如為脂溶性，應(yīng)選擇對(duì)試驗(yàn)菌株毒性低且無(wú)致突變性的有機(jī)溶劑，常用的有二甲基亞砜（dmso）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為100μl。
9 劑量的設(shè)計(jì)
決定受試物max高劑量的標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)細(xì)菌的毒性及其溶解度。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細(xì)菌存活數(shù)減少，都是毒性的標(biāo)志。
對(duì)原料而言，一般max高劑量組可為5mg/皿或5µl/皿。對(duì)產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，max高劑量可為max低抑菌濃度，無(wú)殺菌作用的受試物，max高劑量可為原液。受試物至少應(yīng)設(shè)四個(gè)劑量組。每個(gè)劑量均做三個(gè)平行平板。
10 試驗(yàn)操作步驟
10.1 增菌培養(yǎng)
取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5ml，加入無(wú)菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩（100次/min）培養(yǎng)10h。該菌株培養(yǎng)物應(yīng)每毫升不少于1-2×109活菌數(shù)。
10.2 平板摻入法
實(shí)驗(yàn)時(shí)，將含0.5mmol/l*－0.5mmol/l*-0.5mmol/l*溶液（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加*）的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0ml分裝于試管中，45℃水浴中保溫，然后每管依次加入試驗(yàn)菌株增菌液0.1ml，受試物溶液0.1ml和磷酸鹽緩沖液0.5ml或者s9混合液0.5ml（需代謝活化時(shí)），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培養(yǎng)箱里孵育48—72h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。
實(shí)驗(yàn)中，除設(shè)受試物各劑量組外，還應(yīng)同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、溶劑對(duì)照、陽(yáng)性誘變劑對(duì)照和無(wú)菌對(duì)照。
11 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷
記錄受試物各劑量組、空白對(duì)照（自發(fā)回變）、溶劑對(duì)照以及陽(yáng)性誘變劑對(duì)照的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
如果受試物ta1535、ta1537、wp2uvra的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的三倍或三倍以上，受試物ta97、ta97a、ta98、ta100、ta102、wp2uvra（pkm101）的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的二倍或二倍以上，并出現(xiàn)以下情形之一，則該受試物判定為致突變陽(yáng)性，
（1）呈劑量-反應(yīng)關(guān)系
（2）任何一個(gè)劑量條件下，出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)并有可重復(fù)性
受試物經(jīng)上述五個(gè)試驗(yàn)菌株測(cè)定后，只要有一個(gè)試驗(yàn)菌株，無(wú)論在加s9或未加s9條件下為陽(yáng)性，均可報(bào)告該受試物細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)為致突變陽(yáng)性。如果受試物經(jīng)五個(gè)試驗(yàn)菌株檢測(cè)后，無(wú)論加s9和未加s9均為陰性，則可報(bào)告該受試物為致突變陰性。