葡聚糖凝膠柱使用及注意事項
1 sephadex g型葡聚糖凝膠只適合在水中使用,sephadex g-25羥丙化后就是sephadex lh-20。其既有分子篩作用,在由極性與非極性溶劑組成的溶劑中還有反相層析效果。雖然價位很高,但由于性能頗佳,可再生利用,所以倍受親睞。此外上柱樣品損失很少,對處理小樣品較好,這也是我們實驗室常用的原因之一。
2 sephadex lh20 的原理。
sephadex lh20的分離原理主要有兩方面:以凝膠過濾作用為主,兼具反相分配的作用(在反相溶劑中)。因為凝膠過濾作用,所以大分子的化合物保留弱,先被洗脫下來,小分子的化合物保留強,后出柱。如果使用反相溶劑洗脫, sephadex lh20對化合物還起反相分配的作用,所以極性大的化合物保留弱,先被洗脫下來,極性小的化合物保留強,后出柱。如果使用正相溶劑洗脫,這主要靠凝膠過濾作用來分離。
3 sephadex lh20 洗脫溶劑。
看完第2點后,就應(yīng)該清楚sephadex lh20 洗脫溶劑因分為兩類:反相和正相兩種。用得多的是反相溶劑洗脫,以甲醇--水系統(tǒng)為常見,先用水,逐漸增加甲醇比例,后用100%甲醇沖柱。正相系統(tǒng)以lv仿--甲醇為常見,先用50%lv仿--甲醇,逐漸增加甲醇比例,后用100%甲醇沖柱。
4 sephadex lh20 樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。
如果樣品極性大,這選用反相溶劑洗脫(甲醇--水),樣品用少體積的甲醇--水(盡可能甲醇少一些)溶解,過濾后,濕法上樣(一定要濾喔!要是把sephadex lh20 堵啦,就得將sephadex lh20 的柱頭部分棄去,很心痛呀)。如果樣品極性小,這選用正相溶劑洗脫(lv仿--甲醇),樣品用少體積的lv仿--甲醇溶解,過濾后,濕法上樣。
5 sephadex lh-20的步驟。
(1) 選擇條件:
梯度洗脫在sephadex使用中并不象在正相柱層析中那么重要。首先你的樣品須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統(tǒng);極性小者一般用不含水的系統(tǒng)。我們實驗室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統(tǒng),用了很多年,效果較好。
(2) 飽和層析柱:
用洗脫劑將凝膠搖勻,直立柱身,讓其自然沉降,此時要防止氣泡留在其中。至少半小時打開開關(guān),流出幾個柱體種的洗脫劑,目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。
(3) 樣品處理:用盡量少的洗脫劑溶解樣品,常壓過濾。
(4) 濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。
(5) 洗脫:控制流速,一般1drop/s以下,可參見廠家的一些參數(shù);必要時更改極性(很多時一個極性就可以將樣品洗脫完畢)。
再生以備下次使用。
6 分離的技巧,后說說我的使用心得
(1) 流速不可太快,切切不可新急,所謂欲速則不達(dá)。
(2)柱子盡可能長, sephadex lh20 柱長的增加將*地改善分離,所不要吝惜填料,寧可將填料全裝在一根大柱子中,不要將填料裝成幾根小柱。所謂集中優(yōu)勢兵力,打擊敵人。
(3) 餾分一定要接的細(xì),可1/10,或1/20 個保留體積接成一餾分。
(4) 洗脫體積一般為2-3個保留體積,對特殊保留強的化合物,可洗脫5個保留體積。
(5)鞣質(zhì)成分死吸附嚴(yán)重,如不在乎填料者,可用sephadex lh20 分鞣質(zhì)。
(6)sephadex lh20 對黃酮類成分的分離效果,方法很成型,有大量文獻(xiàn)參考。
(7)填料反復(fù)使用,每次用完,一般可用甲醇將柱子洗干凈,然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來,待用。
sephadex lh-20是由葡聚糖g-25羥丙基化加工而成,屬于分子篩凝膠,尤其適用于天然產(chǎn)物在有機溶劑中的純化。例如:類固醇、萜類、脂類以及小分子多肽等,pharmadex lh-20同時適用于分子類別非常相似的物質(zhì)的分離和工業(yè)規(guī)模的制備,既可用于初步純化步驟,也可用于終精制步驟,如非對映同分異構(gòu)體的分離。
1.裝柱
裝填的重要原則之一就是需要形成一個穩(wěn)定均一的柱床。膠顆粒越均一(粒徑分布越窄),越容易獲得穩(wěn)定均一的柱床。但是對于sephadex lh-20而言,25~100μm的粒徑范圍相對于許多用于制備色譜的填料而言,不能說分布均一,也就是說其粒徑分布較寬。然而當(dāng)膠溶脹后就相對容易得到均一的柱床。這對于長柱(zui高至250cm)而言也是同樣的。在裝柱前,層析柱和儲槽都必須進(jìn)行*的清洗。
sephadex lh-20在使用之前必須進(jìn)行溶脹。在溶脹的過程中,要盡量避免過分?jǐn)嚢?,否則會破壞球形膠粒,且要避免使用磁力攪拌器。
在室溫下,將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時,溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統(tǒng),請參考后頁之干膠溶脹表計算特定柱體積所需要干膠的量。使溶脹膠體積沉淀之后占總體積的75%,上層溶劑占25%,這時,懸浮液從一個容器倒入另一容器時膠??梢苿印⑷苊浐蟮哪z根據(jù)裝柱要求均勻倒入柱內(nèi),在保證膠粒不變形的前提下,應(yīng)在盡可能高的壓力下裝柱,反壓不要超過1.5ba。
2.平衡
上樣前,用洗脫液平衡層析柱至少兩個柱體積直到基線變得平穩(wěn)為止,如改變?nèi)軇?yīng)該注意凝膠在新溶劑中的溶脹性質(zhì),并根據(jù)性質(zhì)確定柱高調(diào)節(jié)器的位置,如使用相同的溶劑,在以后的層析中柱平衡可以省略。
3.洗脫液
為確保延長層析柱的使用壽命,所有的緩沖液都應(yīng)該離心或經(jīng)過0.45um的膜過濾以除去雜質(zhì)。
4.樣品
樣品體積應(yīng)該占柱總體積的1-2%,同樣在使用之前樣品應(yīng)該離心或經(jīng)過0.45um的膜過濾。
5.洗脫
洗脫流速應(yīng)根據(jù)情況而定,大線性流速約12cm/min(反壓1.5ba),建議流速為1-10cm/h??傮w來說,較低的流速,具有較高的分辯率。
6.再生
凝膠再生通常是先用2-3個柱體積的洗脫液進(jìn)行清洗,如更換洗脫液,則需要重新平衡。
7.體積流速與線性流速的關(guān)系
線性流速=體積流速/橫截面積
8.溶脹體積
由于sephadex lh-20的溶脹體積依賴于溶劑,所以對于不同直徑的柱可根據(jù)比例增加或減少舊柱體積以便計算出新體積。
新體積=舊體積×(新柱體積/舊柱體積)
9.膠的性質(zhì)
sephadex lh-20同時具備親水和親脂雙重性質(zhì),且被分離物質(zhì)的極性在分離過程中起著重要作用。
10.排阻極限 4-5kd(與所用溶劑有關(guān))
11.上樣量
吸附模式 取決于所需分辯率
分子量大小 小于總體積的20%
正相分配 小于總體積的1%
12.其他
膠粒形狀 球形,多孔
顆粒大?。ǜ桑?18-111um(直徑)
顆粒大小中間值(干) 70um(直徑)