熒光標(biāo)記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)是指具有共軛雙鍵化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，當(dāng)受到某一波段光照射時(shí)激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)基態(tài)時(shí)可發(fā)出熒光。熒光標(biāo)記技術(shù)是將熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息。熒光標(biāo)記具有的無放射物污染、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，使其在許多研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛，如免疫病理、細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞學(xué)。
索萊寶salexa fluor熒光素抗體標(biāo)記試劑盒中的salexa fluor熒光素連接有n-羥基琥珀酰亞胺（nhs）酯，nhs酯可以和伯胺反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價(jià)酰胺鍵并釋放出nhs基團(tuán)。一般一個(gè)igg分子結(jié)合2~8個(gè)salexa fluor熒光素分子可達(dá)到良好的熒光標(biāo)記效果。
產(chǎn)品信息
試劑盒組分
組分
數(shù)量
salexa fluor熒光素
1
ph調(diào)整緩沖液(0.1ml)
1
1*pbs(1ml)
2
dmso(0.1ml)
1
純化柱
2
收集管
2
試劑盒規(guī)格
一個(gè)試劑盒可標(biāo)記100μg~2mg抗體
使用說明
01
抗體準(zhǔn)備
1
建議抗體濃度調(diào)整到1~2mg/ml。
2
使用本試劑盒標(biāo)記的抗體溶液，ph在6.5~8.5為宜，最好為pbs緩沖液。緩沖液中不應(yīng)當(dāng)含有bsa等蛋白，也不應(yīng)當(dāng)含有甘氨酸或tris等含有游離氨基的鹽類，否則可能會影響標(biāo)記效果。
02
抗體標(biāo)記
1
取出salexa fluor染料離心數(shù)秒，將管中干粉甩至管底。注：未離心前請勿開蓋，以免造成損失。
2
salexa fluor管中加入40ml dmso用漩渦混勻儀混勻10~20s，至salexa fluor全部溶解，瞬離5~10s，使溶解后的salexa fluor溶液離心至管底。
3
抗體中加入1/10體積的調(diào)整緩沖液。
4
將溶解后的salexa fluor加入抗體中(每0.1mg抗體中加入2mlsalexa fluor)，用移液槍反復(fù)吹打混勻或用漩渦混勻儀混勻10~20s。
5
將抗體與salexa fluor混合物置水平搖床或旋轉(zhuǎn)混勻儀，在搖動狀態(tài)下室溫避光反應(yīng)1~2小時(shí)。
03
游離salexa fluor染料的去除
1
將純化柱下方堵頭掰斷，1000×g離心1 min倒掉保護(hù)液，將純化柱移至新的收集管中。
2
將0.2 ml pbs加入管中，待全部滲入填料后，1000×g離心1min，重復(fù)2次。
3
將標(biāo)記反應(yīng)液加入到純化柱填料表面。如果樣品體積小于50ml，用試劑盒中的pbs補(bǔ)齊至50ml。上樣體積最大不要超過200ml。
4
待樣品滲入填料后，1000×g離心2min，收集純化的蛋白溶液。
5
將抗體標(biāo)記物4℃避光保存待用。
04
標(biāo)記抗體保存
標(biāo)記抗體可4℃避光保存，也可以根據(jù)需要選擇加入bsa、防腐劑、甘油等成分保證產(chǎn)品穩(wěn)定。
*推薦保存液：0.01m pbs(ph7.4)含1%bsa,0.03%
proclin300和50%甘油，可-20℃保存一年。
05
染料-蛋白質(zhì)比率的計(jì)算
1
用pbs稀釋少量標(biāo)記蛋白。
2
使用路徑長度為1cm的比色皿，在280nm處測量吸光度和特定染料的amax（見附表）
3
計(jì)算蛋白質(zhì)濃度
c(mg/ml)={[a280-(amax× cf)]/1.4}×稀釋因子。
√c是染料-蛋白共軛物濃度；
√a280和amax分別是在280nm處的吸光值以及在amax波長處的吸光值；
√cf是染料校正因子見附表；
√稀釋因子是在光度測量時(shí)的稀釋倍數(shù)
4
計(jì)算標(biāo)記率的方法如下
dol=(amax×mwt×稀釋因子）/(ε×c)
√c是染料-蛋白共軛物濃度；
√mwt是igg的分子量；
√ε是染料的摩爾吸光系數(shù)見附表。
注意事項(xiàng)
1. nhs酯類染料對水分敏感，salexa fluor需現(xiàn)用現(xiàn)配；
2. 低濃度的疊氮鈉（0.02%）和10%甘油不會明顯干擾蛋白質(zhì)的標(biāo)記。但含有氨基的溶液及大于10%甘油對抗體的標(biāo)記效率有較大影響。標(biāo)記前應(yīng)盡量去除干凈；
3. 試劑盒組份在運(yùn)輸過程中可能造成顛倒，會使液體或干粉試劑沾到管壁或瓶蓋上。使用前請離心處理，以使附著管壁或瓶蓋的液體或干粉試劑沉積到管底；
4. dmso屬微毒類，對人體皮膚有滲透性，眼有刺激作用，使用時(shí)避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。
附表
*：以nm為單位的激發(fā)波長
ε：amax時(shí)的摩爾消光系數(shù)(m-1cm-1)
cf：校正系數(shù)(a280/amax)
相關(guān)產(chǎn)品
貨號
名稱
salk0001
salexafluor350
抗體標(biāo)記試劑盒
salk0002
salexafluor405
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salexafluor488
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salexafluor532
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salexafluor555
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salexafluor680
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salk0013
salexafluor750
抗體標(biāo)記試劑盒