一、關(guān)于夾心elisa
夾心elisa測定兩層抗體（即捕獲抗體和檢測抗體）間的抗原。靶抗原必須包含至少兩個能夠結(jié)合到抗體的抗原位點。
夾心elisa去掉了分析前的樣品純化步驟，提高了靈敏度（比直接或間接法靈敏2–5倍）。
二、實驗步驟
1.用捕獲抗體包被
①以捕獲抗體濃度為1-10μg/ml的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (ph9.6)包被pvc微量滴定板的孔。②未純化抗體（例如腹水液或抗血清）可能需要增加樣品蛋白質(zhì)的濃度（嘗試用10μg/ml）補償濃度更低的特異性抗體。③用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在4℃下孵育過夜。④棄去包被液，并洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200μlpbs。在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去溶液或洗滌液。在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴。?
2.封閉和加樣①每孔添加 200μl 封閉緩沖液（5% 脫脂奶粉/pbs）封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。②用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少1-2小時，或在4℃下孵育過夜。③用200 μl pbs洗滌微量滴定板兩次。④將100 μl 稀釋樣品添加到每個孔。通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每板都必須測定標準品（兩重測定或三重測定）和空白樣品。37°c條件下孵育90分鐘。確保標準品濃度涵蓋抗體結(jié)合的大部分動態(tài)檢測范圍?？赡苄枰獌?yōu)化濃度范圍以獲得合適的標準曲線。通常樣品和標準品采取兩重測定或三重測定。⑤移除樣品，用200μl pbs洗滌微量滴定板兩次。
3.用檢測抗體和二抗孵育
①將100μl稀釋的檢測抗體添加到每個孔。?確保檢測抗體識別與捕獲抗體靶蛋白的不同表位。這可防止對抗體結(jié)合的干擾。盡可能使用已測試的成對匹配抗體。②用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育2小時。③用pbs洗滌微量滴定板四次。④添加100μl偶聯(lián)二抗，使用前將其在封閉緩沖液中稀釋。⑤用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育1-2小時。⑥用pbs洗滌微量滴定板四次。
三、檢測
辣根過氧化物酶(hrp)和堿性磷酸酶(alp)是elisa測定法中常用的兩種檢測酶。
考慮到某些生物材料具有高水平內(nèi)源酶活性（例如肺泡細胞中的高水平alp、紅細胞中的高水平過氧化物酶），這可能會導致非特異性信號。如有必要，用左旋咪唑（針對alp）或用0.3% h2o2的甲醇溶液（針對過氧化物酶）進行另外的阻斷處理。
alp底物
對硝基苯磷酸鹽(pnpp)是大多數(shù)應用常用的底物。室溫孵育15–30分鐘后在405 nm處測定硝基苯酚呈現(xiàn)的黃色，并加入等量0.75m naoh 終止反應。
hrp顯色液
hrp的底物為過氧化氫。過氧化氫的裂解與氫供體的氧化偶聯(lián)，反應期間氫供體的氧化使顏色發(fā)生變化。
tmb（3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺）
將tmb溶液添加到每個孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液(2m h2so4)，然后在450nm 處讀取光密度。
opd（鄰苯二胺二yan酸鹽）
在492 nm下測定終產(chǎn)物。底物對光敏感，應將其存放在暗處。
abts（2,2’-聯(lián)氮-雙-[3-乙基-苯并噻唑啉-6 磺酸] 二銨鹽）
終產(chǎn)物為綠色，可在416nm處測定光密度。
某些酶底物被認為是有害的（潛在致癌物），因此應始終小心處理并佩戴手套。
四、數(shù)據(jù)分析
由系列稀釋液得到的數(shù)據(jù)繪制標準曲線，濃度標在x軸（對數(shù)標度）上，而吸光度標在y軸（線性標度）上。通過內(nèi)插法在此標準曲線上得出樣品濃度。