本試劑盒僅供科研使用
谷氨酸脫羧酶（gad）測定試劑盒說明書
（貨號：ws2011f 分光法 24 樣） 一、產品簡介： 谷氨酸脫羧酶 (gad，ec 4.1.1.15)是一種吡哆醛類裂解酶，能專一的催化 l-谷氨酸 裂解成為 γ-氨基丁酸 (gaba)和 co2。gad 廣泛分布于動植物和微生物中：哺乳動物 體內 gad 催化產生的 gaba 是一種重要的抑制性神經遞質；在植物中 gad 的活性高 低可指示種子發(fā)芽能力和出苗率等。 本試劑盒利用苯酚和次氯酸鈉比色法測定谷氨酸脫羧酶（gad）催化產生的 gaba， 最終生成藍色物質，該物質在 645nm 處有明顯光吸收，其顏色深淺與 gaba 含量呈正 比，進而得出 gad 活力大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 30ml×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 6ml 試劑二溶解備用。 試劑二 液體 12ml×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 20ml×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 1.5ml×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 12ml×1 瓶 4℃保存 試劑六 a：液體 4.4ml×2 瓶 b：液體 5ml×1 瓶 4℃保存 臨用前取 2.2ml 的 b 液進一瓶 a 液 中，混勻后作為試劑六使用?；靹?后的試劑半個月內用完。 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該標曲。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1ml 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、離心機、可調式移液器。 四、谷氨酸脫羧酶（gad）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、 樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min， 取上清液待用。 ② 細菌/細胞樣本：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細 胞加入 1ml 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200w，超聲 3s，間隔 10s， 重復 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 ③ 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、 上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 645nm，蒸餾水調零。 ② 在 ep 管依次加入： 試劑名稱（μl） 測定管 對照管 樣本 100 100 試劑一 200 試劑二 200 混勻，40℃孵育 30min。本試劑盒僅供科研使用 2 試劑三 200 200 混勻，室溫 12000rpm，離心 3min，上清液待測。 ③ 顯色反應：在 ep 管中依次加入： 上清液 200 200 試劑三 125 125 試劑四 25 25 試劑五 200 200 試劑六 200 200 混勻，20℃放置 20min，取全部澄清上清液至 1ml 玻 璃比色皿（光徑 1cm）中，于 645nm 處讀取各管的 a 值，△a=a 對照-a 測定(每個樣本需做一個自身對照)。 【注】若δa 值在零附近，可增加樣本質量 w（如增至 0.2g），或延長 40℃孵育時間 t（如增 至 1h 或更長），或加大樣本量 v1（如增至 300μl，則試劑三相應減少），則改變后的 w 和 t 和 v1 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線：y = 2.0976x - 0.0059，x 為標準品摩爾質量(μmol)，y 為吸光值δa。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘產生 1nmol 的 gaba 定義為一個酶活力單位。 gad(nmol/min/mg prot)=[(δa+0.0059)÷2.0976]×(v2÷v3)÷(v1×cpr)÷t×103 =397.3×(δa+0.0059)÷cpr 3、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每分鐘產生 1nmol 的 gaba 定義為一個酶活力單位。 gad(nmol/min/g 鮮重)=[(δa+0.0059)÷2.0976]×(v2÷v3)÷(w×v1÷v)÷t×103 =397.3×(δa+0.0059)÷w 4、按細胞數量計算： 單位定義：每 104個細胞每分鐘產生 1nmol 的 gaba 定義為一個酶活力單位。 gad(nmol/min/104 cell)=[(δa+0.0059)÷2.0976]×(v2÷v3)÷(500×v1÷v)÷t×103 =0.8×(△a+0.0059) 5、按照液體體積計算： 單位定義：每毫升液體每分鐘產生 1nmol 的 gaba 定義為一個酶活力單位。 gad(nmol/min/ml)=[(δa+0.0059)÷2.0976]×(v2÷v3)÷v1÷t=397.3×(δa+0.0059) v---提取液體積，1ml； v1---加入反應體系中樣本體積，0.1ml； v2---反應體系總體積：0.5ml； v3---第②步顯色階段上清液量，0.2ml； t---反應時間，30min； w---樣本質量，g； 標準品 gaba 分子量---103.12； 500---細胞數量，萬； cpr---樣本蛋白質濃度，mg/ml，建議使用本公司的 bca 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 標準品母液（1mg/ml）：向 ep 管中加入 2ml 蒸餾水；把母液稀釋成以下濃度梯度的標準品：0, 0.06, 0.12, 0.18, 0.24, 0.3 mg/ml。也可根據實際樣本來調整標準品濃度。 2 按照顯色反應階段的測定管加樣體系操作，根據結果即可制作標準曲線。