關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，有許多常用的轉(zhuǎn)染試劑。下面簡(jiǎn)單介紹下lipo3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟及注意事項(xiàng)。
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：lipofectamine™ 3000轉(zhuǎn)染試劑、opti-mem（可以用無(wú)血清的培養(yǎng)基代替）
實(shí)驗(yàn)步驟：
1.接種細(xì)胞，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到70–90%匯合度。
注：對(duì)于hek293，6孔板一般鋪50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞左右。對(duì)于pc9, 24孔板一般鋪5-10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。由于不同細(xì)胞，生長(zhǎng)狀況不太一樣，需要根據(jù)情況調(diào)整。
2.使用opti-mem™培養(yǎng)基稀釋lipofectamine™ 3000試劑，充分混勻。
3.使用opti-mem™培養(yǎng)基稀釋dna，制備dna預(yù)混液，然后添加p3000™試劑，充分混勻。
4.將上面兩步溶液合在一起，混勻并孵育10-15mins。
5.將混勻后的溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，并輕輕搖晃培養(yǎng)基，使其均勻。
6.37°c孵育細(xì)胞2–4天，然后分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
注意事項(xiàng)：
1.opti-mem需要37℃水浴鍋預(yù)熱。
2.轉(zhuǎn)染sirna至細(xì)胞時(shí)，在稀釋sirna時(shí)不要加入p3000™試劑。
3.關(guān)于lipo3000的用量，比如6孔板推薦用量有兩個(gè)3.75ul和7.5ul，最di看轉(zhuǎn)染效率，zui高看細(xì)胞耐受。
4. opti-mem與lipo3000預(yù)混及opti-mem、質(zhì)粒及p3000預(yù)混，都不需要各自孵育，而且兩者混合后孵育時(shí)間最多不要超過(guò)15mins。
5.轉(zhuǎn)染中和轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)基中最好不要含有雙抗。
對(duì)于比較好轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如hek293，而且需要大量轉(zhuǎn)染的時(shí)候，可以使用pei進(jìn)行轉(zhuǎn)染，畢竟lipo3000比較貴。例如，在做co-ip實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要10cm皿轉(zhuǎn)染好幾種質(zhì)粒，就可以用pei進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。