研究背景胰腺癌是消化道常見惡性腫瘤之一，在腫瘤領(lǐng)域有“癌癥”的稱號(hào)。據(jù)柳葉刀雜志記載，胰腺癌確診后的五年生存率約為10%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。胰腺癌臨床癥狀隱匿且不典型，是診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤。因此適用于研究胰腺癌生理特性和治療方案的類器官模型，作為一種疾病模型和再生醫(yī)學(xué)，在胰腺領(lǐng)域至關(guān)重要，也被越來越多的科研工作者所關(guān)注并使用。
胰腺類器官的現(xiàn)狀
目前, 類器官培養(yǎng)技術(shù)在很多器官(如胃、腸、肝、膽、腦等)中都取得了較好的進(jìn)展。胰腺是人體內(nèi)的一個(gè)既是外分泌腺又是內(nèi)分泌腺的特殊臟器。因此, 胰腺類器官技術(shù)的發(fā)展面臨很大的挑戰(zhàn)。
胰腺分為外分泌部和內(nèi)分泌部?jī)刹糠郑夥置谙儆上倥莺拖俟埽▽?dǎo)管）組成，內(nèi)分泌腺由胰島組成，外分泌腺是胰腺炎和胰腺導(dǎo)管腺癌（pdac）的起源部位。我們對(duì)人類胰腺疾?。ò╬dac）的起源和進(jìn)展的了解有限，因?yàn)殡m然胰腺導(dǎo)管類器官和胰島類器官技術(shù)日趨優(yōu)化，但是體外培養(yǎng)中維持人腺泡和導(dǎo)管細(xì)胞存在挑戰(zhàn)，如何構(gòu)建復(fù)合型胰腺類器官仍是當(dāng)前研究的難點(diǎn)。
胰腺類器官可以由健康的胰腺或胰腺腫瘤產(chǎn)生，并構(gòu)成體外和體內(nèi)模型之間的重要翻譯橋梁。文章報(bào)道了人類多能干細(xì)胞對(duì)胰腺導(dǎo)管和腺泡類器官的誘導(dǎo)，這些類器官具有新生兒外分泌胰腺的特性。我們開發(fā)了一種可再生的導(dǎo)管和腺泡類器官來源，用于模擬外分泌發(fā)育和疾病，具體方案和操作如下：
培養(yǎng)方案
1.細(xì)胞準(zhǔn)備
胰腺祖細(xì)胞由研究團(tuán)隊(duì)從hues-8 細(xì)胞中提取，收集s1+4 d誘導(dǎo)階段的pp2細(xì)胞團(tuán)，并用tryple解離成單細(xì)胞。將消化的細(xì)胞以1500 rpm離心5分鐘，然后用含有5%基質(zhì)膠的分化培養(yǎng)基重懸，最終細(xì)胞密度為50000/ml。將細(xì)胞懸液接種在預(yù)涂有基質(zhì)膠的培養(yǎng)板中，每四天更換一次培養(yǎng)基，并補(bǔ)充5%基質(zhì)膠。
2. 胰腺導(dǎo)管誘導(dǎo)
對(duì)于導(dǎo)管細(xì)胞誘導(dǎo)，分化（堿性）培養(yǎng)基培養(yǎng)基中含有dmem，1%pen-strep，1%b-27，10 ng/mlfgf-1，50 μg/ml抗壞血酸，1 μma 83-01，10 ng/mlfgf-10，1 ng/mlegf。
i 期（第0-4天）導(dǎo)管培養(yǎng)基含有堿性培養(yǎng)基，并添加10 μmy-27632、50 nmsb939、3 μmiwp-2、25 nmiq-1、50 nmicrt14、15 ngfgf-10、10 ng/mlfgf-2、5 ng/mlegf。
ⅱ期（第4-8天）導(dǎo)管培養(yǎng)基含有堿性培養(yǎng)基，并添加3 μmiwp-2、25 nmiq-1、50 nmicrt14、5 μmy-27632。
iii期（第8-12天）導(dǎo)管培養(yǎng)基含有堿性培養(yǎng)基，并添加3 μmiwp-2、25 nmiq-1、50 nmicrt14，0.1 μmxav-939。
iv期（第12天）導(dǎo)管培養(yǎng)基含有堿性培養(yǎng)基，并添加3 μmiwp-2、5 nmiq-1、10 nmicrt14。
圖1.a. 導(dǎo)管樣和腺泡樣類器官誘導(dǎo)方案示意圖 b.16天培養(yǎng)期間類器官的相位對(duì)比圖像(n = 3，獨(dú)立培養(yǎng))，比例尺，50毫米
圖2.dus和ac培養(yǎng)16天胰導(dǎo)管標(biāo)志物sox9 (a)、hnf1b (b)、caii (c)、cftr (d)的rna表達(dá)。
圖3.免疫熒光檢測(cè)sox9 (e)和caii(f)無機(jī)物的表達(dá)
3. 胰腺腺泡誘導(dǎo)
對(duì)于腺泡誘導(dǎo)，堿性培養(yǎng)基含有dmem，1%pen-strep，1%b-27，10 ng/mlfgf-1，50 μg/ml抗壞血酸，1 μma 83-01，10 ng/ml wnt1。
i 期腺泡（第 0-4 天）培養(yǎng)基含有堿性培養(yǎng)基，并添加10 μmy-27632、3 μmskl 2001、50 nm地塞米松、0.3 μmchir-99021、50 nmxmu-mp-1、15 ng/ml wnt1、5 ng/mlfgf-2、1 ng/mlegf、5 ng/mlfgf-10。
ⅱ期（第4-8天）腺泡培養(yǎng)基含有堿性培養(yǎng)基，并添加3 μmskl 2001、200 nm地塞米松、0.1μmldn193189、50 nmxmu-mp-1。
iii期（第8-12天）腺泡培養(yǎng)基含有堿性培養(yǎng)基，并添加3 μmskl 2001、200 nm地塞米松、0.1 μmldn193189、1 μmdbz。
iv期（第12天）腺泡培養(yǎng)基含有堿性培養(yǎng)基，并添加0 .3 μmskl 2001、25 nm地塞米松、0.1 μmdbz。
對(duì)于tgf-β處理的實(shí)驗(yàn)，從第83天開始從培養(yǎng)基中去除a 83-01。
圖4.dus和ac培養(yǎng)16天胰腺腺泡標(biāo)記物ptf1a (g)、rbpjl (h)和cpa1 (i)的rna表達(dá)
圖5.免疫熒光檢測(cè)類器官中ptf1a (j)和cpa1 (k)的表達(dá)
化合物信息匯總?cè)缦卤硭荆?br>化合物名稱
貨號(hào)
規(guī)格
penicillin-streptomycin(100×)
60162es
100 ml
b-27 supplement without vitamin a,serum free,50x
60704es
10 ml
l-抗壞血酸
53614es
1 g/5 g
forskolin
51001es
10/50/100 mg
retinoic acid(維甲酸,維a酸)
53001es
100/500 mg/1 g
a 83-01
53002es
1/5/10 mg
y-27632
53006es
1/5/10 mg
chir-99021
53003es
2/5/10 mg
doxycycline (powder)
60204es
1/5/25 g
dexamethasone地塞米松
53269es
250/500 mg/1 g
ldn193189
53012es
5/10 mg
iwp-2
53013es
5/10/50 mg
skl 2001
53542es
10/50 mg
xav-939
52904es
10/25 mg
dbz
52984es
2/5/10/25 mg
xmu-mp-1
53544es
2/5 mg
iq-1
53541es
10/25 mg
icrt14
53552es
5/25 mg
sb939 (pracinostat)
53840es
2/5 mg
fgf-1
91301es
10/100/500 μg
fgf-10
91306es
5/100/500 μg
fgf-2
91330es
10/100/500 μg
egf
92708es
100/500 μg
參考文獻(xiàn)
[1] huang l,et al. commitment and oncogene-induced plasticity of human stem cell-derived pancreatic acinar and ductal organoids. cell stem cell. 2021 jun 3;28(6):1090-1104.e6. doi: 10.1016/j.stem.2021.03.022. epub 2021 apr 28. pmid: 33915081; pmcid: pmc8202734.