總超氧化物歧化酶(sod)檢測試劑盒(nbt核黃素微板法)的產(chǎn)品簡介
產(chǎn)品簡介：
超氧化物岐化酶(superoxide dismutase, sod)是含金屬輔基的酶，能催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成過氧化氫(h2o2)和氧氣(o2)，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，由于超氧自由基是不穩(wěn)定的的自由基，壽命極短，sod 活性一般用間接方法測定，并利用各種呈色反應(yīng)來測定 sod 活力，其中顯色劑有 nbt(唑藍(lán)四氮)、wst-1、wst-8 等。總超氧化物歧化酶(sod)檢測試劑盒(nbt 核黃素微板法)(total superoxide dismutase assay kit with nbt)是一種基于 nbt 的光還原反應(yīng)，所以又稱作 nbt 光還原法，檢測原理是在有氧化物質(zhì)存在下核黃素被光還原，在有氧條件下，被還原的核黃素極易再氧化產(chǎn)生超氧陰離子自由基(o2.-)，o2.-可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有強(qiáng)吸收，而 sod 可清除超氧陰離子(o2.-)，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明 sod 活性愈低，反之酶活性愈高，據(jù)此通過酶標(biāo)儀比色分析就可以計(jì)算出樣品中總超氧化物岐化酶活性水平。本方法是利用 sod 抑制 nbt 在光照下的還原作用來確定酶活性大小，可用于檢測植物、組織、細(xì)胞、血清或其它樣品中 sod 活性。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。
自備材料：
1、生理鹽水或 pbs
2、電子天平、剪刀、低溫冰箱或制冰機(jī)、冰袋、勻漿器或研缽、離心機(jī)、離心管、小試管、 光照培養(yǎng)箱光源或 40w 熒光燈或日光燈、測光儀(照度計(jì))、酶標(biāo)儀、96 孔板
操作步驟(僅供參考)：
1、樣品處理：
①血漿或含紅細(xì)胞的樣品：從待測樣品中分理出的血清或血漿不應(yīng)有溶血，如果含有應(yīng)去除紅細(xì)胞后檢測，如超過檢測范圍，用 sod 提取試劑稀釋后檢測；血清去除紅細(xì)胞的
簡易方法如下：用抗凝管收集血液，顛倒混勻，取至少500μl 全血，4℃ 3000r/min 離
心5min，轉(zhuǎn)移上清至另一新的 1ml 離心管中，適量生理鹽水稀釋后待測，亦可采用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，如 ack 紅細(xì)胞裂解液等。
②組織樣品：動物用含有 20u/ml heparin 的生理鹽水(0.9% nacl containing 20u/ml
heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品，按照每 100mg 組織加入 500μl sod 提取試劑
的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿，4℃ 4000r/min 離心 10min，取上清液(sod
粗提液)用于酶活性的測定。
③細(xì)胞樣品：對于貼壁細(xì)胞，由于后續(xù)用于酶活性的測定，避免使用胰酶消化細(xì)胞，可以使用細(xì)胞刮或 edta 處理細(xì)胞并收集細(xì)胞，細(xì)胞用無菌的 pbs 或生理鹽水洗滌 1 次，按照每 106細(xì)胞加入300~500μl sod 提取試劑的比例，用玻璃勻漿器在 4℃或冰浴勻漿，4℃ 10000r/min 離心 10min，取上清液(sod 粗提液)用于酶活性的測定。
④植物樣品：準(zhǔn)確稱取植物材料(果肉或者去葉脈的葉片)0.4g，剪碎，置于 4℃預(yù)冷的研缽或勻漿器中，加入預(yù)冷 sod 提取試劑 1ml，低溫研磨至勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管，用 3ml
sod 提取試劑沖洗研缽或勻漿器并轉(zhuǎn)入離心管，加提取試劑至總體積為 4ml，4℃ 4000r/min 離心 20min，上清液為酶提取液，上清液可用于 sod 的檢測。注意：如果
sod 酶活性較低，應(yīng)相應(yīng)減少提取試劑的總體積，以便提高 sod 酶的濃度。
⑤上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以用 bca 法測定蛋白濃度，通常 10~20μg 蛋白的細(xì)胞或組織 勻漿液樣品其中的 sod 平均活力約 1 個活力單位(不同細(xì)胞和組織的差異會比較大，該活力范圍僅作為初步的參考)；每種樣品準(zhǔn)備 20~100μg 蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測，根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計(jì)的蛋白使用量，用該試劑盒提供的 sod 提取試劑適當(dāng)稀釋樣品，例如小鼠肝臟組織 10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為 10%)上清，通常需要稀釋 10~100 倍，準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測定，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能完成測定，可以-20℃凍存，但建議盡量當(dāng)天完成測定。
2、(選做)準(zhǔn)備 sod 標(biāo)準(zhǔn)品：需自備 sod 標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的 sod 提取試劑將 sod標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度：200、100、50、20、10、5、2u/ml，各取 20μl 參考樣品進(jìn)行檢測。注意：為避免稀釋后 sod 酶活性的下降， sod 標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用，本試劑盒對于 sod 的檢測并不需要 sod 作為標(biāo)準(zhǔn)品，但可使用 sod 標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照或作為對 sod 活性定量的參考。
3、選取合適的光源：在光照培養(yǎng)箱或日光燈下，用光度儀測定光度值為 3500~4000lx 的
適合光照反應(yīng)的位置，做出標(biāo)記。
4、配制 nbt 工作液：將 met 緩沖液與 nbt 溶液按 23:3 的比例混合即可。
5、sod 加樣：參考下表使用 96 孔板設(shè)置空白對照孔、光照對照孔、測定孔，在低光強(qiáng)條件下按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液，加入 fd 溶液后充分混勻。注意：加入
fd 溶液后反應(yīng)即會開始，在低光強(qiáng)條件下用排槍操作可減小各孔間因加入試劑的時間先后差異而導(dǎo)致的誤差。
6、sod 測定：混勻，取空白對照孔置于暗處，其他各孔置于 4000lx 日光下反應(yīng) 20min，
各孔受光情況應(yīng)一致，溫度高時時間可縮短，低時延長；反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的空白對照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀測定560nm 處吸光度。
計(jì)算：
sod 活力單位的定義：以抑制 nbt 光化還原的 50%為一個酶活性單位(u)。
液體中總sod 活力(u/ml)=(a光照－a測定)/(50%×a光照×vt)
組織、細(xì)胞勻漿液中總sod 活力(u/g)=(a光照－a測定)×v/(50%×a光照×vt×w)
血液中總sod 活力(u/ghb)=(a光照－a測定)×v×c/(50%×a光照×vt×hb)
式中：a光照=光照對照孔的吸光度
a測定=測定孔的吸光度
v=樣品液總體積(ml)
vt=測定時樣品所用體積(ml)
w=樣品鮮質(zhì)量(g)
c=1ml/采血量(ml)
hb=血紅蛋白含量(ghb/ml)
注意事項(xiàng)：
1、 上述低溫試劑避免反復(fù)凍融，以免失效或效率下降。待測樣品-70℃可保存 1 個月，需注意反復(fù)凍融會導(dǎo)致 sod 部分失活。
2、 植物中的多酚類物質(zhì)會引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取 sod 酶時，必須添加多酚類物質(zhì)的吸附劑，將多酚物質(zhì)除去，避免酶蛋白變性失活。sod 提取試
劑含有pvp 等成分，可有效去除多酚類物質(zhì)。sod 提取試劑不夠用可以用磷酸鈉緩沖液(0.05m,ph7.8)替代。
3、 細(xì)胞或組織等樣品制備時，不能采用含有 triton x-100 等去垢劑的溶液，否則會干擾本試劑盒的檢測。
4、 抗氧化物會對本試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾，例如 0.1mm ascorbic acid，5mm gsh 都
會使測定出來的吸光度顯著升高。
5、 對于植物樣品，研磨處理應(yīng)迅速，以免 sod 酶活下降，盡量在冰浴條件下處理。
6、 如果用分光光度計(jì)，比色杯光徑應(yīng)為 1cm，加入的上清及試劑量應(yīng)根據(jù)比色杯的最小
要求體積而定。
7、 所用離心管或 96 孔板應(yīng)潔凈透明，透光性好。
8、 一般要求各孔受光情況一致，所有反應(yīng)管應(yīng)排列在與日光燈燈管平行的直線上。
9、 反應(yīng)溫度控制在 25℃，視酶活性高低適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時間；溫度較高時，光照時間應(yīng)縮
短；溫度較低時，光照時間相應(yīng)延長。
10、 如果無 4000lx 日光，可 200w 在 10~12cm 處，照射 20min；超凈工作臺 5cm 處光強(qiáng)約 800~1000lx，,照射 30~40min；強(qiáng)太陽光下一般光強(qiáng)可達(dá) 30000lx，照射 5~15min，一般不建議直接用太陽光。
11、 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
有效期：6 個月有效，4℃運(yùn)輸和保存。
總超氧化物歧化酶(sod)檢測試劑盒(nbt核黃素微板法)的產(chǎn)品簡介
關(guān)鍵詞：酶標(biāo)儀 電子天平 制冰機(jī) 離心機(jī) 光照培養(yǎng)箱