漲知識(shí) | 克隆專題一：不同分子克隆方法介紹（上）
克隆是英文“clone”或“cloning”的音譯，而英文“clone”則起源于希臘文“klone”，原意是指以幼苗或嫩枝插條。1963年j.b.s.haldane在題為“人類種族在未來(lái)二萬(wàn)年的生物可能性”的演講上采用“克?。╟lone）”的術(shù)語(yǔ)，把“克隆技術(shù)”帶到了人們的視野中。
克隆技術(shù)又稱為“生物放大技術(shù)”，目前應(yīng)用泛的技術(shù)為“分子克隆”，又稱重組dna技術(shù)，即通過(guò)重組技術(shù)將目的dna片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來(lái)，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。
隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，分子克隆技術(shù)也隨之更新迭代，從傳統(tǒng)的依賴限制性內(nèi)切酶的方法發(fā)展到如今的ta克隆、topo克隆、無(wú)縫克隆、gateway技術(shù)等等，新的技術(shù)不斷涌現(xiàn)，為分子生物學(xué)的發(fā)展和進(jìn)化提供新的力量。今天小翌就帶領(lǐng)大家認(rèn)識(shí)一下不同的分子克隆方法。
01傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)的依賴于限制性內(nèi)切酶和酶切位點(diǎn)。主要步驟是通過(guò)限制性內(nèi)切酶（翌圣的funicut™快速限制性內(nèi)切酶cat#15001es-15051es）酶切載體和目的基因，通過(guò)連接酶（翌圣t4 dna連接酶cat#10300）將酶切的片段拼接在一起（即連接過(guò)程），形成可以表達(dá)目的基因的新載體（即重組質(zhì)粒），使用轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目的基因的擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄和翻譯。
傳統(tǒng)分子克隆實(shí)驗(yàn)流程如下圖：
圖1.傳統(tǒng)分子克隆實(shí)驗(yàn)流程
該技術(shù)最早由cohen group在1973年實(shí)現(xiàn)，他們將e.coli的tetr質(zhì)粒psclol和nersrr6-3質(zhì)粒體外限制酶切割，連接成新的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化e.coli，在含四環(huán)素和新霉素的平板上篩選出了terrner，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)較為成熟，但是該方法受到限制性酶切位點(diǎn)和連接效率等方面的限制，并不能高效、準(zhǔn)確的克隆需要的目的基因。
圖2.stanley cohen和herbert boyer（第一個(gè)成功實(shí)現(xiàn)基因工程技術(shù)的團(tuán)隊(duì)）
02ta克隆ta克?。╫riginal ta cloning kit），依賴于pcr反應(yīng)中所使用的聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移的活性，通常在克隆片段的3’末端加上a尾（即3’-a），通過(guò)連接酶（翌圣t4 dna連接酶cat#10300）把克隆片段與一個(gè)具有3’-t突出的載體dna連接起來(lái)。主要應(yīng)用于不清楚目的基因dna序列的實(shí)驗(yàn)，通過(guò)ta克隆重組到t-載體后，使用t-載體的上下游引物擴(kuò)增片段，測(cè)序，最終確定目的基因序列。其中，聚合酶的選擇尤為重要，翌圣普通pcr試劑盒（cat#10102/10103/10157）、翌圣快速pcr試劑盒（cat#10157）均具有taq dna聚合酶，擴(kuò)增后的pcr產(chǎn)物具有3’-da突出端，可輕松克隆至t載體。
圖3. ta克隆流程示意圖【3】
03topo克隆topo克隆技術(shù)是通過(guò)topo載體上偶聯(lián)的異構(gòu)酶(topoisomerase)實(shí)現(xiàn)插入片段的快速克隆。其原理是利用topo載體兩端通過(guò)磷酸鍵偶聯(lián)的topo酶，在連接反應(yīng)中，受插入片段的5'端羥基的攻擊，磷酸鍵釋放能量。利用該能量，插入片段5'端羥基與載體片段3'端磷酸基團(tuán)連接在一起，topo異構(gòu)酶從載體分子上脫落，完成連接反應(yīng)。不同于傳統(tǒng)的ta克隆，topo克隆能夠在2-5 min內(nèi)快速完成插入片段和載體的連接反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單，連接效率。
圖4. topo克隆原理
目前市面上的產(chǎn)品，需根據(jù)dna片段末端的不同，選擇不同的topo克隆試劑盒。而翌圣新品零背景通用型topo克隆試劑盒（cat#10906），能夠兼容平末端產(chǎn)物或粘性末端產(chǎn)物，不受片段末端影響，快速克隆連接，效率高，陽(yáng)性率接近100%，如圖5所示。
圖5.topo ta/blunt克隆試劑盒輕松連接2 kb（10 ng）平末端/粘性末端片段注：a&b：topo克隆轉(zhuǎn)化平板。c&d：插入片段pcr鑒定電泳圖。
04無(wú)縫克隆技術(shù)傳統(tǒng)克隆和ta克隆兩種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，過(guò)程繁冗，為了解決限制性酶切位點(diǎn)的限制，科學(xué)家們研發(fā)出新的、快速、簡(jiǎn)潔、高效的克隆技術(shù)——無(wú)縫克隆，區(qū)別于傳統(tǒng)分子克隆，的差異在于載體末端和引物末端應(yīng)具有15-20個(gè)同源堿基，由此得到的pcr產(chǎn)物兩端便分別帶上15-20個(gè)與載體序列同源性的堿基，依靠堿基間作用力互補(bǔ)配對(duì)成環(huán)，不經(jīng)過(guò)酶切，pcr產(chǎn)物和線性化載體在同源重組酶的作用下，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間和溫度即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆。
圖6.同源重組原理
無(wú)縫克隆技術(shù)最早是2009年由daniel gibson和j. craig venter發(fā)展起來(lái)，廣泛應(yīng)用的方法包括兩種gibson assembly和in-fusion cloning，原理都是通過(guò)外切酶產(chǎn)生黏性末端，再通過(guò)同源重組酶的連接得到重組片段，但是兩種方法的外切酶不同，形成重組序列的方式也不一樣。gibson assembly：包含t5 exonuclease、phusion dna polymerase和taq dna ligase三種酶，通過(guò)5’→3’ t5核酸外切酶活性，沿著5’→3’方向降解dsdna，產(chǎn)生3’黏性末端，通過(guò)同源臂互補(bǔ)配對(duì)，退火后借助phusion dna聚合酶修復(fù)片段上的缺口，taq dna連接酶催化片段形成磷酸二酯鍵，將所有缺口補(bǔ)齊，獲得重組片段。
圖7. gibson assembly原理圖【5】
in-fusion cloning：具有3’→5’ 核酸外切酶，能夠識(shí)別3’末端堿基，沿著3’→5’ 方向降解dsdna，產(chǎn)生5’黏性末端，同源臂互補(bǔ)，退火后配對(duì)，因?yàn)槠洳缓B接酶，所以要將重組片段轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，序列中的缺口會(huì)在感受態(tài)體內(nèi)補(bǔ)平、連接，獲得重組片段。
圖8. in-fusion cloning原理【6】
翌圣同源重組試劑盒利用無(wú)縫克隆技術(shù)，僅需50℃反應(yīng)20 min即可轉(zhuǎn)化，完成定向克隆，克隆陽(yáng)性率可達(dá)95%以上。其中，翌圣一步法快速克隆試劑盒（cat#10911es）可連接單片段，該試劑盒已發(fā)文章累計(jì)if達(dá)到1000+。翌圣通用型一步法快速克隆試劑盒（cat#10922es）可連接1-6片段，最長(zhǎng)連接片段可達(dá)23 kb，是多片段連接的。通過(guò)上述的介紹，相信大家已經(jīng)初步了解了目前實(shí)驗(yàn)室中常用的分子克隆技術(shù)，那么還有哪些新開(kāi)發(fā)的分子克隆技術(shù)呢？無(wú)縫克隆中不常見(jiàn)、特殊的分子克隆技術(shù)又有哪些呢？關(guān)注我們，小翌會(huì)在下一期的分子克隆技術(shù)專題中，給大家介紹新的分子克隆技術(shù)，為您的實(shí)驗(yàn)帶來(lái)新的思路與方向，期待下一次的見(jiàn)面~
05相關(guān)產(chǎn)品列表
產(chǎn)品定位
產(chǎn)品名稱
產(chǎn)品貨號(hào)
規(guī)格
通用緩沖液，5min完成精準(zhǔn)酶切
funicut™快速限制性內(nèi)切酶
15001es-15051es
50 t
常規(guī)pcr
2×hieff®pcr master mix(with dye)
10102es03/08
1 ml/5×1 ml
常規(guī)pcr，不含染料
2×hieff®pcr master mix(no dye)
10103es03/08
1 ml/5×1 ml
快速pcr，快至1s/kb
2×hieff®ultra-rapid hotstart pcr master mix(with dye)
10157es03/08
1 ml/5×1 ml
topo克隆-兼容ta/平末端
hieff clone®universal zero topo ta/blunt cloning kit
10906es20
20 t
topo克隆-ta末端
hieff clone®zero topo-ta cloning kit 零背景topo-ta克隆試劑盒
10907es20
20 t
topo克隆-平末端
hieff clone®zero topo-blunt cloning kit
10909es20
20 t
單片段一步克隆，已發(fā)文章累計(jì)if達(dá)到1000+
hieff clone®plus one step cloning kit一步法快速克隆試劑盒
10911es20/50
20 t/50 t
1-6片段一步克隆，最快5分鐘完成重組反應(yīng)
hieff clone®universal one step cloning kit通用型一步法快速克隆試劑盒
10922es20/50
20 t/50 t
參考文獻(xiàn)
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