高效液相色譜法測定巴豆中巴豆苷的含量

發(fā)布時間：2024-05-01

高效液相色譜法; 巴豆; 巴豆苷
methods: the determination was done by using reversephase highperformance liquid chromatography with a hedera ods2 column (4.6 mm ×250 mm, 5 μm). elution was employed with the phase of acetonitrilemethanolwater (1︰4︰95) at flow rate of 1.0 ml/min. the detection wavelength was set at 292 nm and the column temperature was 25 ℃. injection volume was 10 μl.
results: the linear range of isoguanosine was from 0.161 to 0.967 mg. the correlation coefficient of the calibration curves was 0.999 8. the average recovery rate was 98.78% with relative standard deviation of 0.02%.
conclusion: the results show that the method is simple, accurate, and repeatable, and it is suitable for quality control of semen crotonis tiglii.
keywords: highperformance liquid chromatography; semen crotonis tiglii; isoguanosine
巴豆為大戟科植物巴豆croton tigliun l.的干燥成熟果實，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品。其性熱味辛，有大毒，歸胃、大腸經(jīng)，瀉下作用猛烈，外用于惡瘡疥癬，疣痣［1］。現(xiàn)代藥理研究表明巴豆主要具有致炎、致瀉［2，3］，促腫瘤發(fā)生［4］，降低機體**功能［5］及抗腫瘤作用［68］。既往對其化學成分的研究主要集中于對巴豆油的分析，如有報道用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀采用面積歸一化法確定巴豆和巴豆霜中揮發(fā)性成分的相對百分含量［9］。2005年版《中國藥典》中僅有巴豆油含量測定［1］，未曾收載有關(guān)巴豆的毒性成分如巴豆**、巴豆苷、牽牛子苷的含量標準和使用*等方面的內(nèi)容，而作為一味臨床較為常用的有毒中藥，使用稍有不慎，極易引發(fā)中毒事件，不利于臨床安全用藥。同時，由于其質(zhì)量控制標準的欠缺，使得醫(yī)務(wù)工作者投鼠忌器，限制了巴豆藥材在臨床上的應(yīng)用。由于巴豆中的毒性成分在某些病理狀態(tài)下也是其發(fā)揮療效的有效成分，因而更有必要對其展開研究。雖有文獻報道巴豆苷、巴豆**的提取及藥理活性研究［10，11］，但至今尚未有測定這些成分的方法報道。本研究采用高效液相色譜法(highperformance liquid chromatography，hplc)對10批次不同產(chǎn)地的巴豆中巴豆苷含量進行測定，從而為有效地控制巴豆藥材質(zhì)量提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑 agilent1100液相色譜儀［包括四元梯度泵、自動進樣器、恒溫柱溫箱、二極管陣列檢測器(diode array detector，dad)和agilent chemstation色譜工作站］，美國agilent公司生產(chǎn)； ag285電子天平，瑞士mettler公司生產(chǎn)；kq500e型*，江蘇昆山超聲儀器有限公司生產(chǎn)。乙腈、甲醇為色譜純，實驗用水為三蒸水。
巴豆藥材080815批次和080816、080817批次產(chǎn)地分別為廣西、四川，購于浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠；080301批次購于河北安國市神禾中藥材飲片有限責任公司，產(chǎn)地為四川；、和批次購于云南向輝生物科技有限公司，產(chǎn)地皆為云南；081206、090205、090210批次購于山東魯安中藥飲片有限公司，產(chǎn)地分別為四川、云南、甘肅。以上藥材均由南京中醫(yī)藥大學生藥學教研室吳德康教授鑒定為大戟科植物巴豆croton tigliun l.的干燥成熟果實。巴豆苷對照品(成都普思生物科技有限公司，批號為090302)用hplc面積歸一化法測定其純度≥98.5%。
1.2 實驗方法
1.2.1 色譜條件 漢邦hedera ods2色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈甲醇水(1︰4︰95)，流速為1 ml/min，檢測波長292 nm，柱溫25 ℃，進樣量10 μl。
1.2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 十八烷基硅烷鍵合硅膠(octadecylsilane chemically bonded silica，ods)為填充劑，理論塔板數(shù)按巴豆苷峰面積計算應(yīng)不低于5 000，巴豆苷與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5，色譜峰拖尾因子在0.95～1.05。巴豆苷的保留時間為11.8 min?？瞻兹芤簾o干擾。
1.2.3 對照品溶液制備 精密稱取巴豆苷對照品適量，置25 ml量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成含0.806 mg/ml的巴豆苷標準品溶液。
1.2.4 供試品溶液制備 取各批次巴豆藥材種仁，研碎，過二號篩。粉末置50 ℃烘箱中干燥2 h，取出，于干燥器中放置至室溫，備用。取粉末約0.3 g，精密稱定，置索式提取器中，加50 ml，加熱回流3 h，后棄去液。藥渣揮干溶劑，連同濾紙桶移入具塞錐形瓶中，精密加入水50 ml，稱定重量，超聲(300 w，24 hz)提取20 min，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
1.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對照品儲備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml，分別置于10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，使巴豆苷濃度分別為0.016 1、0.032 2、0.048 3、0.064 4、0.080 6、0.096 7 mg/ml。將各對照品液分別進樣10 μl，重復(fù)2次，測定。
1.2.6 重復(fù)性實驗 精密吸取質(zhì)量濃度為0.048 3 mg/ml的對照品溶液10 μl，連續(xù)進樣6次，測定，峰面積相對標準差(relative standard deviation，rsd)為0.12%。
1.2.7 精密度實驗 平行精密稱定過二號篩的巴豆種仁粉末0.3 g，共6份。精密稱定，按1.2.4中供試品制備方法處理，測定巴豆苷含量。巴豆苷的平均含量為11.7 mg/g，rsd為2.39%。
1.2.8 穩(wěn)定性實驗 選取重復(fù)性實驗樣品溶液中的1份做穩(wěn)定性實驗，在1.2.1色譜條件下，精密吸取10 μl，每隔2小時進樣1次，測定18 h內(nèi)巴豆苷的峰面積。巴豆苷峰面積rsd為0.50%，表明樣品在18 h內(nèi)穩(wěn)定。
1.2.9 加樣回收率實驗 精密稱取同批干燥樣品0.15 g，平行6份，置索式提取器中，加50 ml，加熱回流3 h，后棄去液，藥渣揮干溶劑。連同濾紙桶移入具塞錐形瓶中，分別加入對照品適量，再精密加入水50 ml，稱定重量，超聲(300 w，24 hz)提取20 min，放冷。再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。進樣測定。
1.2.10 樣品測定 分別精密稱取10批次巴豆藥材，每批號3份，樣品處理同前，精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，測定，計算巴豆苷含量。
2 結(jié)果
2.1 標準曲線 按照線性關(guān)系考察方法操作，以峰面積積分值(a)對濃度(c)進行線性回歸，得到回歸方程：a=18 213c－56.51，r＝0.999 8(n=6)。線性范圍為0.161～0.967 mg。
2.2 回收率的測定 巴豆苷的平均加樣回收率為98.78%，rsd為0.02%(n=6)。見表1。
2.3 樣品含量測定結(jié)果 10個批次巴豆藥材中巴豆苷平均含量為10.2～16.2 mg/g。見表2和圖1。
表1 巴豆苷回收率(略)
table 1 recovery rates of isoguanosine
表2 樣品中巴豆苷含量(略)
table 2 determination of isoguanosine in semen crotonis tiglii
圖1 對照品和供試品的hplc圖譜(略)
figure 1 hplc chromatograms of reference substance and sample
a: reference substance; b: sample; 1: isoguanosine.
3 討論
3.1 流動相的選擇 本研究對流動相的系統(tǒng)組成進行了比較研究，分別試用了乙腈水(10︰90、2 ︰98、5︰95)、甲醇水(5︰95)、乙腈甲醇水(2︰3︰95、3︰2︰95)等系統(tǒng)。隨著流動相中乙腈比例增加，巴豆苷保留時間縮短、峰分離度減小且峰對稱性降低，當控制在2%以下時，各參數(shù)達到*佳。同時隨著流動相中甲醇含量增加，巴豆苷保留時間增加、峰分離度增大，但峰對稱性在4%時達到*佳。因此根據(jù)分離情況和峰型形狀，認為乙腈甲醇水(1︰4︰95)系統(tǒng)比較適宜巴豆苷的質(zhì)量分析。
3.2 色譜柱的選擇 選用色譜柱hypersil ods柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、hedera ods2(4.6 mm×250 mm，5 μm)。分別采用同一體系和比例的流動相，乙腈甲醇水(1︰4︰95)進行色譜分離。結(jié)果表明以色譜柱hedera ods2(4.6 mm×250 mm，5 μm)、hypersil ods柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)分離效果均佳。
3.3 提取條件的選擇 巴豆苷具有較強的水溶性。預(yù)實驗中對巴豆樣品中巴豆苷的提取條件進行了比較，采用l9(34)正交表進行正交設(shè)計，對提取溶媒(水、20%甲醇、50%甲醇)、提取方式(超聲300 w、500 w，回流)、提取時間(20、30、50 min)進行考察。結(jié)果表明，3個因素對巴豆苷含量實驗結(jié)果皆無顯著影響。因此從省時、節(jié)約、提取效率高、提取*的前提出發(fā)，確定供試品溶液的*佳提取條件為取過二號篩的巴豆種仁粉末約0.3 g，精密稱定，置索式提取器中，加50 ml，加熱回流3 h，后棄去液，藥渣揮干溶劑。連同濾紙桶移入具塞錐形瓶中，精密加入水50 ml，稱定重量，超聲(300 w)提取20 min，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。
3.4 10批次巴豆含量分析 本研究測定了不同批次不同產(chǎn)地的巴豆中巴豆苷的含量，其藥材的hplc圖譜基本一致，10批次飲片中巴豆苷的平均含量為12.0 mg/g，其中*低含量為10.2 mg/g，*高為16.2 mg/g。
3.5 巴豆苷測定方法總述 在2005年版《中國藥典》中沒有巴豆苷含量測定項，本實驗建立了以巴豆苷為指標的巴豆含量測定方法，該方法簡便，精密度和重現(xiàn)性好，平均回收率為98.78%，rsd為0.02%，可作為有效分析方法用于巴豆藥材的質(zhì)量分析與控制。
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