癌癥由于其很高的患病率和致死率成為一直困擾著我們的問(wèn)題，目前也有許多治療癌癥的方法，其中饑餓療法由于較低的副作用，吸引了很多人的目光。雖然營(yíng)養(yǎng)饑餓療法可以在多種癌癥中產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤作用，已有研究表明癌細(xì)胞可以利用腫瘤微環(huán)境 (tme) 在營(yíng)養(yǎng)不良的環(huán)境中茁壯成長(zhǎng)。
在今年 12 月 6 日，cell metabolism 上發(fā)表了一篇名為 ”cancer cells co-opt nociceptive nerves to thrive in nutrient-poor environments and upon nutrient-starvation therapies” 的文章。文章表明在口腔粘膜癌的低糖環(huán)境中，癌細(xì)胞利用活性氧觸發(fā)的 c-jun 的激活來(lái)分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (ngf)，ngf 調(diào)節(jié)痛覺(jué)神經(jīng)以產(chǎn)生降鈣素基因相關(guān)肽 (cgrp)，cgrp 隨后會(huì)通過(guò) rap1 介導(dǎo)的 mtor-raptor 相互作用的破壞來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)性自噬 (圖 1)?？固墙徒夂涂寡苌傻臓I(yíng)養(yǎng)饑餓療法都會(huì)加劇癌細(xì)胞和痛覺(jué)神經(jīng)的這種惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致痛覺(jué)神經(jīng)成為癌癥進(jìn)展的微環(huán)境的幫兇。
保護(hù)性自噬：自噬是癌細(xì)胞進(jìn)行抗癌治療時(shí)的一種保護(hù)機(jī)制，能使癌細(xì)胞逃避凋亡。癌細(xì)胞對(duì)多種抗癌藥物的耐藥性可通過(guò)上調(diào)自噬而增加。
饑餓療法：主要是通過(guò)阻斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)抑制腫瘤生長(zhǎng)。治療策略主要包括：靶向抑制促血管生成因子及其受體和整合素以抗腫瘤血管生成；抑制糖酵解、抑制氨基酸代謝等方式抑制腫瘤細(xì)胞代謝過(guò)程等。圖1. 該研究通路機(jī)制圖
痛覺(jué)神經(jīng)有助于 oscc 腫瘤生長(zhǎng)■ 痛覺(jué)神經(jīng)存在于 tme 且促進(jìn) oscc 進(jìn)展作者通過(guò)對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌 (oscc) 小鼠和病人的研究發(fā)現(xiàn)，與正常粘膜相比，不典型增生和浸潤(rùn)性癌中 trpv1+ 痛覺(jué)神經(jīng)密度更高 (圖 2a)。降鈣素基因相關(guān)肽 (cgrp) 通常被用作痛覺(jué)活性的分子指標(biāo)，cgrp 在 oscc 病人組織中的癌癥相關(guān)痛覺(jué)神經(jīng)中被檢測(cè)到，并且 cgrp+ 痛覺(jué)神經(jīng)比例越高的患者總生存率越低。然而癌細(xì)胞本身并不會(huì)表達(dá) cgrp，癌癥相關(guān)痛覺(jué)神經(jīng)的高活性會(huì)導(dǎo)致 oscc 患者的癥狀惡化，在 oscc 進(jìn)展中起到重要作用。為了進(jìn)一步研究癌癥相關(guān)痛覺(jué)神經(jīng)對(duì)癌癥進(jìn)展的作用，作者在 balb/c 裸鼠的舌粘膜下層 (該區(qū)域與痛覺(jué)神經(jīng)軸突末梢在解剖學(xué)上相鄰) 接種人 oscc 細(xì)胞系 cal27 或黑素瘤細(xì)胞系 b16f10 以建立骨科舌異種移植模型，這些模型中均檢測(cè)到了神經(jīng)生態(tài)位和高比例的 cgrp+ 神經(jīng)，并且從第 8 天開(kāi)始，小鼠血漿中鼠 cgrp 緩慢增加 (圖 2b)，這意味著小鼠痛覺(jué)活性升高。在用辣椒素 (hy-10448) 對(duì)小鼠的痛覺(jué)神經(jīng)進(jìn)行化學(xué)去神經(jīng)化后，cal27 和 b16f10 腫瘤均變小了 (圖 2c)。這些表明癌癥相關(guān)痛覺(jué)神經(jīng)有助于腫瘤生長(zhǎng)。圖 2. 口腔黏膜癌存在于痛覺(jué)神經(jīng)密度高的微環(huán)境 (tme) 中，有助于腫瘤生長(zhǎng)a: 4-**喹啉1-氧化物(4nqo) 誘導(dǎo)的小鼠 oscc 泛神經(jīng) (pgp9.5+) 和痛覺(jué)神經(jīng) (trpv1+pgp9.5+/pgp9.5+) 密度的定量分析 (normal mucose: 正常粘液；dysplasia：不典型增生；invasive carcinoma：浸潤(rùn)性腫瘤); b: cal27 異種移植小鼠在時(shí)間點(diǎn)血漿中的人鼠 cgrp 水平，鼠cgrp水平顯著升高，人cgrp水平?jīng)]有顯著變化; c: cal27 和 b16f10 異種舌移植體積，使用辣椒素 (cap) 處理后腫瘤體積顯著減小
■ 痛覺(jué)神經(jīng)在低糖環(huán)境下促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)葡萄糖和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以深刻影響 tme 中的癌細(xì)胞-基質(zhì)/免疫細(xì)胞相互作用。在小鼠異種舌移植模型中，腫瘤組織中葡萄糖含量的下降與鄰近正常組織相比明顯更大，這表明腫瘤在口腔粘膜中快速消耗葡萄糖，同時(shí)該模型具有更高水平的應(yīng)激反應(yīng)蛋白和糖酵解酶 (圖 3a)，高糖酵解活性可能有助于 oscc 腫瘤的低糖環(huán)境。在低糖培養(yǎng)條件下用 tg cm (三叉神經(jīng)節(jié)條件培養(yǎng)基) 培養(yǎng)時(shí)，所有三種腫瘤細(xì)胞系 (hn6、cal27 和 b16f10) 的生長(zhǎng)都得到了促進(jìn) (圖 3b)。當(dāng)癌細(xì)胞被給予 2-脫氧-d-葡萄糖 (2-dg, 用于模擬低糖環(huán)境) 時(shí)也觀察到類似的效果。此外，在 cal27 細(xì)胞中，tg cm 增加了增殖細(xì)胞核抗原 (pcna) 的水平 (圖 3c)。這些結(jié)果表明，在體外低糖環(huán)境下，痛覺(jué)神經(jīng)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。
在小鼠體內(nèi)模型中，痛覺(jué)神經(jīng)去神經(jīng)化 (辣椒素處理，cap dene) 減少腫瘤生長(zhǎng)，瘤內(nèi)葡萄糖含量的增加 (30% 葡萄糖水處理) 逆轉(zhuǎn)了去痛覺(jué)神經(jīng)化 (nociceptive denervation) 所介導(dǎo)的抗生長(zhǎng)作用 (圖 3d)。用辣椒素刺激痛覺(jué)神經(jīng)，在低糖環(huán)境 (2-dg) 下顯著促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng) (圖 3e)。這些結(jié)果表明，痛覺(jué)神經(jīng)也促進(jìn)了體內(nèi)低糖環(huán)境下癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
圖 3. 痛覺(jué)神經(jīng)在低糖環(huán)境中促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)
a: 糖酵解和應(yīng)激反應(yīng)蛋白水平和組織葡萄糖含量的變化；b: hn6、cal27 和 b16f10 細(xì)胞在培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng) (n=3)；c: 在培養(yǎng)條件下 24h 時(shí)，cal27 細(xì)胞的 pcna 和裂解的 caspase-3 蛋白水平；d-e: cal27 異種舌移植模型中經(jīng)不同處理后的腫瘤體積
神經(jīng)源性 cgrp 對(duì)癌癥發(fā)展的影響■ 在低葡萄糖環(huán)境中介導(dǎo)痛覺(jué)神經(jīng)促進(jìn)癌癥發(fā)展神經(jīng)可以釋放許多分子，包括代謝物、神經(jīng)肽和核酸，以調(diào)節(jié) tme。煮沸的 tg cm 會(huì)失去促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，而用 dnase 和 rnase 預(yù)處理的 cm 保留了其促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，表明該生長(zhǎng)促進(jìn)作用并不是由核酸介導(dǎo)的。cgrp 通常被用作痛覺(jué)活性的分子指標(biāo)，為了探究低葡萄糖環(huán)境中痛覺(jué)神經(jīng)對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)作用是否由 cgrp 介導(dǎo)，作者用 rimegepant (cgrp 受體拮抗劑) 阻斷 cgrp 信號(hào)，發(fā)現(xiàn) tg cm (添加三叉神經(jīng)節(jié)的培養(yǎng)基) 介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)被顯著抑制 (圖 4a)。用 sirna 在 cal27 細(xì)胞中敲低 cgrp 結(jié)合相關(guān)受體 (ramp1 和 clr) 也會(huì)抑制 tg cm 的促生長(zhǎng)作用。
進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，在小鼠瘤內(nèi)注射重組人 cgrp (rhcgrp) 可以拯救去痛覺(jué)神經(jīng)化介導(dǎo)的 cal27 腫瘤生長(zhǎng)抑制 (圖 4b)，在 cal27 細(xì)胞中敲除 clr 也會(huì)抑制辣椒素刺激的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，神經(jīng)源性 cgrp 在低糖環(huán)境下介導(dǎo)痛覺(jué)神經(jīng)對(duì)癌細(xì)胞的促生長(zhǎng)作用。
圖 4. 神經(jīng)源性 cgrp 在低糖環(huán)境中介導(dǎo)痛覺(jué)神經(jīng)對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)作用
a: 體外 cal27 細(xì)胞在處理 48 小時(shí)的生長(zhǎng)情況；b: cal27 異種舌移植模型腫瘤體積
■ 在人類 oscc 進(jìn)展過(guò)程中異常升高
為了研究神經(jīng)源性 cgrp 在人類 oscc 進(jìn)展過(guò)程中的影響，作者對(duì)人類 oscc 組織進(jìn)行了組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在具有高 gcrp 神經(jīng)生態(tài)位的近端腫瘤區(qū)域，癌細(xì)胞的比例更高。腫瘤組織中 calca (編碼 cgrp) 水平較高的患者的生存率更低。與健康人相比，oscc 患者術(shù)前血漿 cgrp 水平顯著升高。clr 水平越高，oscc 患者的總體生存率越差。這些結(jié)果表明，神經(jīng)源性 cgrp 及其受體 clr 在 oscc 進(jìn)展過(guò)程中異常升高，并與較差的臨床病理特征和患者結(jié)局相關(guān)。
■ 在低糖環(huán)境中誘導(dǎo)癌細(xì)胞保護(hù)性自噬
為了尋求低糖環(huán)境中痛覺(jué)神經(jīng)和神經(jīng)源性 cgrp 促進(jìn)生長(zhǎng)作用的機(jī)制，作者比較了與 rhcgrp 孵育或不孵育的 cal27 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，以及在高糖培養(yǎng)或低糖培養(yǎng)下的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)僅在低糖培養(yǎng)下改變表達(dá)的基因與多種自噬途徑顯著相關(guān)。在低葡萄糖培養(yǎng)和 2-dg 處理下，用 tg cm 處理癌細(xì)胞可顯著提高 lc3b-ii 水平，降低 p62 水平(圖 5a-b)。同樣條件下用 rhcgrp 處理 cal27 細(xì)胞也得到類似結(jié)果，并上調(diào)了cal27 細(xì)胞中自溶酶體和自噬體的數(shù)量，這些增加的自噬通量都可以被 rimegepant 拮抗。
通過(guò)敲低 atg5 (在自噬形成過(guò)程中不可少) 或 fip200 (在自噬啟動(dòng)過(guò)程中不可少) 抑制自噬通量可以顯著拮抗 tg cm 介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn) (圖 5c)。在體內(nèi)模型中敲低 atg5 后，不管有沒(méi)有 2-dg 處理，去痛覺(jué)神經(jīng)化對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制均沒(méi)有效果 (圖 5d)。這些結(jié)果表明，在低葡萄糖環(huán)境中，痛覺(jué)神經(jīng)促進(jìn)的癌細(xì)胞生長(zhǎng)依賴于自噬通量的增加。
圖 5. 神經(jīng)源性 cgrp 在低糖環(huán)境下通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)性自噬促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)
a-b: 在培養(yǎng)條件下 24 h cal27 細(xì)胞中 lc3b 和 p62 的水平及 lc3b-ii 的凈通量；c: 體外 cal27 細(xì)胞在培養(yǎng)條件下生長(zhǎng) 48 h (n = 3)；d: cal27 異種舌移植模型在不同處理?xiàng)l件的腫瘤體積 (n = 4-5)
■ 上調(diào) rap1 介導(dǎo)的 mtor raptor 相互作用
研究發(fā)現(xiàn)，在低葡萄糖培養(yǎng)條件下 rhcgrp 孵育的 cal27 細(xì)胞中，與 rap1-gtpase 信號(hào)通路相關(guān)的基因明顯上調(diào)，顯著提高了 rap1-gtp 水平，并激活了典型的下游erk通路。通過(guò)敲除 rap1b 來(lái)抑制 rap1 激活能顯著拮抗 cgrp 介導(dǎo)的自噬誘導(dǎo)，并增加 cal27 細(xì)胞中的 pcna (一種增殖標(biāo)志物) 水平 (圖 6a)。在 2-dg 處理的體內(nèi)模型中，rap1 的敲低消除了瘤內(nèi)注射 rhcgrp 誘導(dǎo)的生長(zhǎng)促進(jìn)。這些結(jié)果表明，cgrp 誘導(dǎo)的癌細(xì)胞保護(hù)性自噬依賴于 rap1-gtpase 信號(hào)通路的激活。
rap1 的過(guò)度激活會(huì)使 mtor 通路失活，而這種 mtor 通路失活已知會(huì)激活自噬。作者發(fā)現(xiàn) tg cm 在低糖培養(yǎng)和 2-dg 處理下抑制癌細(xì)胞中 mtor 的磷酸化，這些作用可以被 rimegepan 拮抗。rap1 與 raptor 相互作用，與 rhcgrp 孵育后這種相互作用增強(qiáng) (圖 6b)。rap1 和 raptor 之間的相互作用會(huì)阻礙 mtor 和 raptor 之間的相互作用，從而阻礙 mtor 信號(hào)的激活 (圖 6c)。這些結(jié)果表明，cgrp 介導(dǎo)的 rap1 的激活通過(guò)破壞 mtor raptor 相互作用抑制了 mtor 的磷酸化。圖 6. 神經(jīng)源性 cgrp 通過(guò) rap1 介導(dǎo)的 mtor raptor 相互作用的破壞誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)性自噬
a: 在培養(yǎng)條件下 24 小時(shí)，cal27 細(xì)胞 lc3b 和 p62 水平的變化; b, c: 在 cal27 細(xì)胞中，raptor 與 rap1 以及 raptor 與 mtor 的相互作用
■ 在低糖環(huán)境下，癌細(xì)胞利用痛覺(jué)神經(jīng)產(chǎn)生 cgrp
神經(jīng)源性 cgrp 可以在低糖環(huán)境促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，那么癌細(xì)胞是否可以反過(guò)來(lái)影響tme 中的痛覺(jué)神經(jīng)呢？作者發(fā)現(xiàn)，與 cal27 或 b16f10 細(xì)胞共培養(yǎng)可增加 tgs 中的 calca (編碼 cgrp) 水平，癌細(xì)胞的低葡萄糖培養(yǎng)和 2-dg 預(yù)處理也會(huì)增加 calca 水平。在低糖培養(yǎng)和 2-dg 處理下，cal27 和 b16f10 細(xì)胞中神經(jīng)生長(zhǎng)因子 ngf 水平顯著升高。用 gw-441756 選擇性抑制 ngf 受體不會(huì)影響 hn6、cal27 或 b16f10 細(xì)胞的體外生長(zhǎng)，但會(huì)拮抗癌細(xì)胞介導(dǎo)的 tgs 中 calca 水平的升高。這些結(jié)果表明，癌細(xì)胞來(lái)源的 ngf 在低糖環(huán)境中促進(jìn)痛覺(jué)神經(jīng) calca 的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)痛覺(jué)神經(jīng)產(chǎn)生 cgrp。
作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) c-jun 是觀察到的人類和小鼠 ngf/ ngf 轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)最有可能的調(diào)節(jié)因子 (圖 7a)。jnk-c jun 通路可被活性氧激活，cal27 和 b16f10 細(xì)胞中低糖培養(yǎng)和 2-dg 處理后 ros 水平升高，顯著刺激 jnk-c-jun 活性 (圖 7b)，被激活的 c-jun 定位于 cal27 細(xì)胞的 ngf 位點(diǎn) (圖 7c)，過(guò)氧化氫酶預(yù)處理抑制了癌細(xì)胞 ngf 分泌升高 (圖 7d)。這些結(jié)果表明，在低糖環(huán)境下，癌細(xì)胞分泌 ngf 依賴于 jnk-c-jun 通路。
圖 7. 在低糖環(huán)境下，癌細(xì)胞利用痛覺(jué)神經(jīng)產(chǎn)生 cgrp
a: 確定 c-jun 為人類和小鼠 ngf/ ngf 轉(zhuǎn)錄因子的首候選因子；b: 在培養(yǎng)條件下 2 h, 對(duì) cal27 細(xì)胞 jnk-c-jun 通路的 ib 分析；c: 在培養(yǎng)條件下，在 cal27 細(xì)胞 ngf 啟動(dòng)子上進(jìn)行 c-jun 的 chip-qpcr 檢測(cè)；d: 在培養(yǎng)條件下 24 h，cal27 細(xì)胞分泌 ngf 的情況 (n = 3)
總結(jié)在低糖環(huán)境中觀察到的癌細(xì)胞和痛覺(jué)神經(jīng)之間的雙向相互作用表明，打破這種惡性循環(huán)可能會(huì)增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)饑餓療法的治療效果。在兩類營(yíng)養(yǎng)饑餓療法：糖酵解抑制劑和血管生成抑制劑中，都增加了舌異種移植中的 ngf 水平，增加了 tgs 中 cgrp 含量的上調(diào)。將營(yíng)養(yǎng)饑餓療法藥物與 rimegepant 聯(lián)用破壞癌細(xì)胞和傷害神經(jīng)之間的相互作用，可以有效地增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)饑餓療法的抗腫瘤療效。
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zhang y, et al. cancer cells co-opt nociceptive nerves to thrive in nutrient-poor environments and upon nutrient-starvation therapies. cell metab. 2022 dec 6;34(12):1999-2017.e10.