o引言
茶作為當(dāng)今世界三大飲料之一越來(lái)越受到人們的歡迎。尤其是近年來(lái)，人們生活水平逐步提高，對(duì)茶飲料的保健功能越來(lái)越重視。研究表明，作為茶葉中活性組分之一的茶多糖（tps），具有抗氧化、抗血栓、降血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等多種活性。隨著人們對(duì)多糖生物學(xué)功能的深入認(rèn)識(shí)，從各種天然產(chǎn)物中提取的生物活性多糖的研究成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。20世紀(jì)90年代初，日本學(xué)者清水岑夫認(rèn)為茶葉中治療糖尿病的藥理成分為茶葉多糖，此后有關(guān)茶葉多糖的研究報(bào)道逐年增多。在茶葉加工過(guò)程中有大量的枝葉和灰末等副產(chǎn)品未被利用，因此從這些粗老茶葉和茶葉生產(chǎn)的副產(chǎn)品中提取茶多糖作為保健食品的功能因子，則可變廢為寶。微波輔助浸提技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型物理破壁方法，與傳統(tǒng)熱水浸提方法相比，具有節(jié)能、快速、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于植物有效成分的提取，尤其是以極性溶劑為萃取劑的浸提過(guò)程，但目前尚未在茶多糖加工中使用。福建是一個(gè)產(chǎn)茶大省，尤其以鐵觀音茶最為出名。本文用微波輔助浸提鐵觀音茶多糖，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化微波浸提工藝條件，并對(duì)微波浸提和常規(guī)浸提產(chǎn)品的抗氧化活性進(jìn)行比較，為今后茶多糖高效大規(guī)模的生產(chǎn)，提高茶葉的綜合經(jīng)濟(jì)效益提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
茶葉，市售安溪鐵觀音茶葉。
1.2試劑與儀器
三（羥甲基）胺基甲烷，生化試劑，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)；鄰苯三酚、鄰二氮菲、鹽酸、過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、無(wú)水乙醇及其他試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。dkz電熱恒溫振蕩水槽（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠）；723pc可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）；bs／bt電子天平（德國(guó)賽多利斯股份公司）；re52aa旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；shz-iiid微波爐（上海亞榮生化儀器廠）；tdl一5離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；ph211臺(tái)式酸度測(cè)定儀（北京哈納科技有限公司）。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1）鐵觀音茶多糖的提取將烘干的鐵觀音茶葉粉碎過(guò)篩，經(jīng)乙醚回流脫脂，微波處理一定時(shí)間后于60℃熱水浸提兩次，每次2h，抽濾，合并濾液，減壓濃縮，加入5倍體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)95％的乙醇沉淀，低溫靜置過(guò)夜，4000r／min離心，沉淀加蒸餾水溶解，再次重復(fù)乙醇沉淀的步驟2次，最后一次得到的沉淀用少量水溶解，活性炭脫色后，sevag法脫蛋白質(zhì)4次，濃縮，真空干燥，得到鐵觀音茶多糖。
2）粗多糖得率的計(jì)算多糖含量測(cè)定用苯酚一硫酸法。粗多糖得率的計(jì)算以1g干品中提取出來(lái)的粗多糖占原料總量的百分?jǐn)?shù)表示，計(jì)算公式為：粗多糖得率／％=（o.9×多糖質(zhì)量濃度×提取液體積／原料干重）×100，其中：0.9為葡萄糖的換算系數(shù)；多糖質(zhì)量濃度的單位為ug·ml―1；提取液體積的單位為ml；原料干重的單位為ug。
3）茶多糖對(duì)o2―自由基的清除率0。05mol／ltifs-hci緩沖溶液（ph=8.2）4。4ml，25oc預(yù)熱20min，加人不同濃度的茶多糖溶液0.10ml，再加入25℃預(yù)熱的2.50mmol／l鄰苯三酚0。50ml，混勻后于25℃恒溫反應(yīng)4min，然后用10mol／l鹽酸終止反應(yīng)，于320nm處測(cè)定吸光值。清除率按下式計(jì)算：o2―清除率／％=（1一（a1一a2）／a0）×100，其中：a0一不含茶多糖溶液的吸光值；a1一含有茶多糖溶液的吸光值；a2一含茶多糖但不含鄰苯三酚溶液的吸光值。
4）茶多糖對(duì)·oh自由基的清除率取0。75mmol／l鄰二氮菲溶液1ml，pbs溶液2ml和蒸餾水1ml，充分混勻后，加0.75mmol／l硫酸亞鐵1ml混勻，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01％的過(guò)氧化氫1ml，37℃下保溫60min，于536nm處測(cè)其吸光值ap，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3o％的乙醇1ml代替1ml過(guò)氧化氫，測(cè)得吸光值ag。再用試樣1ml代替1ml蒸餾水，測(cè)得吸光值as，根據(jù)：·oh清除率／％=（as一ap）／（ag一ap）×100計(jì)算·oh清除率。
2結(jié)果與分析
2.1微波提取的正交實(shí)驗(yàn)
根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，選取微波功率、微波時(shí)間、水浴浸提溫度和料液比4個(gè)因素，各取3個(gè)水平，選用l49三的正交表，以多糖得率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，對(duì)微波處理的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差及方差分析，確定最適作用條件。正交實(shí)驗(yàn)的方案與結(jié)果見(jiàn)表1，方差分析見(jiàn)表2。
由表1極差分析可以看出，隨著微波功率的增加，粗多糖得率呈上升趨勢(shì)。微波功率增大，固定物料在單位時(shí)間內(nèi)獲得的能量逐步增加，加劇了茶葉纖維素細(xì)胞的破裂和組織中多糖物質(zhì)分子及萃取溶劑分子的熱運(yùn)動(dòng)，多糖類化合物的溶出與溶劑向組織內(nèi)的滲入相互促進(jìn)，使二者有更充分接觸的機(jī)會(huì)，從而使得率增加。但是比較a2、a3水平的差值與a2、a1水平的差值發(fā)現(xiàn)，得率上升速度變慢，這一點(diǎn)在單因素實(shí)驗(yàn)中也得到了驗(yàn)證，這可能是由于當(dāng)微波功率太大時(shí)，微波對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)選擇性加熱的性能差異減少，一些易溶于水的其他物質(zhì)先被溶解，造成多糖得率降低。同時(shí)，當(dāng)其他條件一定時(shí)，功率過(guò)大，提取液溫度在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到上限值，微波輻射的有效作用時(shí)間會(huì)有所減短，局部溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致多糖類化合物的分解，而且微波功率過(guò)大會(huì)增加多糖提取成本。本實(shí)驗(yàn)中，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接分析，微波功率應(yīng)取a3水平，但考慮到a3與a2水平時(shí)多糖得率相差不大，并且從最大限度保持多糖生物活性的角度出發(fā)，選取a1水平，即微波功率375w為最佳條件。
微波時(shí)間對(duì)茶多糖得率的影響與微波功率的影響類似，即隨微波處理時(shí)間的增加，茶多糖得率逐漸增大，在b水平時(shí)達(dá)最大值。微波加熱可使水等極性分子在微波電磁場(chǎng)中快速轉(zhuǎn)向及定向排列，從而產(chǎn)生撕裂和相互摩擦發(fā)熱，正是這種劇烈運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，有助于多糖成的溶出，從而大大縮短提取時(shí)間。因此，在微波作用下富含水的部分優(yōu)先破壁，而含水少的細(xì)胞則比較滯后，甚至不能被微波破壁，所以微波處理時(shí)間的延長(zhǎng)可以增加這種極性溶劑分子間的摩擦，使其對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞程度加劇。但是微波處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)就會(huì)導(dǎo)致水分蒸發(fā)過(guò)快，從而使得細(xì)胞內(nèi)多糖的提取難以進(jìn)行，并且也可能導(dǎo)致多糖活性的降低。單因素實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)微波處理時(shí)間超過(guò)180s后，茶多糖得率有逐漸下降的趨勢(shì)。因此，對(duì)鐵觀音茶多糖的提取，合適的微波處理時(shí)間為180s。
表1微波提取茶多糖正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表2微波提取茶多糖正交實(shí)驗(yàn)方差分析
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著料液比的減小，鐵觀音茶多糖的得率先增后降，在d2水平達(dá)最大值。多糖從茶葉細(xì)胞到溶劑是一個(gè)由濃度差推動(dòng)的擴(kuò)散過(guò)程，料液比較大時(shí)，固液相中有效成分的濃度差偏小，提取過(guò)程中傳質(zhì)速度慢，多糖溶人溶劑的量少；隨著料液比的減小，兩相濃度差增大，傳質(zhì)速度加快，擴(kuò)散到溶劑里的多糖就越多。但是，從細(xì)胞中提取多糖的過(guò)程除了簡(jiǎn)單的擴(kuò)散過(guò)程之外，還有受細(xì)胞膜影響的阻滯擴(kuò)散過(guò)程，而阻滯擴(kuò)散速度取決于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。增加溶劑用量雖然在一定程度上增大濃度差推動(dòng)力，能促進(jìn)多糖的提取，但是起決定作用的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并沒(méi)有變化，反而可能會(huì)使細(xì)胞中其他物質(zhì)溶出的機(jī)率加大，導(dǎo)致多糖得率降低。而且溶劑用量太多會(huì)對(duì)后面的純化工作帶來(lái)不利影響，因而，本實(shí)驗(yàn)選擇料液比為1：30。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水浴浸提溫度對(duì)得率影響不大，在c，水平時(shí)達(dá)最大值。浸提溫度主要通過(guò)擴(kuò)散系數(shù)來(lái)影響多糖得率，而溫度與擴(kuò)散系數(shù)正相關(guān)，因此要想獲得較高的擴(kuò)散速率，就必須設(shè)法升高提取溫度，并且對(duì)于植物來(lái)源的多糖，溫度升高可以增加植物細(xì)胞膜的通透性，有利于多糖的浸出。不過(guò)溫度過(guò)高也會(huì)使過(guò)多的雜質(zhì)溶出，不但增加分離難度，而且容易導(dǎo)致某些有效成分失活。對(duì)鐵觀音茶多糖的提取，水浴浸提溫度選取6o℃較適宜，
表2表明，微波功率對(duì)多糖得率有極顯著影響，微波時(shí)間和料液比對(duì)粗多糖得率均有顯著影響，各因素對(duì)得率的主次影響順序是：a（微波功率）>d（料液比）>b（微波時(shí)間）>c（水浴浸提溫度），各因素的最佳水平組合為ab，c，d，即：微波功率375w，微波時(shí)間180s，水浴浸提溫度6o℃，料液比1：30。采用此條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到粗多糖的平均得率為2。82％。
2.2茶多糖的抗氧化活性
圖1和圖2表明，鐵觀音茶多糖具有較好的清除o2ˉ·和·oh自由基效果，并且隨著粗多糖濃度的增加，清除率逐漸增強(qiáng)，即，鐵觀音茶多糖對(duì)o2ˉ·和·oh的清除能力與其濃度具有明顯的量效關(guān)系，并且微波處理前后，鐵觀音茶多糖的清除自由基效果并沒(méi)有顯著差異（p>0。05）。圖1中，在低濃度條件下，鐵觀音茶多糖對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的o2ˉ·抑制作用較弱，但在高濃度條件下具有明顯的抑制作用，其對(duì)o2ˉ·的半數(shù)清除質(zhì)量濃度ic50約為600ug/ml，而當(dāng)質(zhì)量濃度為1000ug／ml時(shí)超氧陰離子清除率達(dá)到69％。圖2中，茶多糖濃度較低時(shí)，劑量一效應(yīng)線性關(guān)系較好，隨濃度增加，·oh清除率增加較快，當(dāng)濃度增加到一定程度后，對(duì)-oh的抑制率增加緩慢，劑量一效應(yīng)不符合線性關(guān)系，其對(duì)·oh的半數(shù)清除質(zhì)量濃度ic50約為500ug／ml，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，茶多糖對(duì)羥自由基的最大清除率為78％。
圖1鐵觀音茶多糖對(duì)02-·的清除效
圖2鐵觀音茶多糖對(duì)·oh的清除效
o2ˉ·是生物體內(nèi)主要的活性氧自由基，也是人體內(nèi)由氧衍生出來(lái)的第一個(gè)氧自由基。·oh是已知活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)的一種自由基，對(duì)細(xì)胞內(nèi)dna的破壞作用最大，可造成堿基被破壞，從而產(chǎn)生遺傳突變。近年來(lái)關(guān)于茶多糖抗氧化作用的報(bào)道越來(lái)越多，并有人據(jù)此解釋了茶多糖多種生物學(xué)功能的藥理學(xué)基礎(chǔ)，這些報(bào)道都表明，茶多糖的抗氧化作用和它的結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。研究表明，茶多糖是含有10％左右蛋白質(zhì)的糖蛋白，組成單糖以半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖為主，還有木糖和甘露糖等，其抗氧化作用機(jī)制可能是茶多糖中的一些活性位點(diǎn)（如帶有酚羥基的氨基酸）捕捉了自由基或與之產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)，或茶多糖大分子將自由基包埋起來(lái)使其無(wú)法進(jìn)行氧化反應(yīng)。
同時(shí)，由于茶多糖結(jié)構(gòu)中存在大量的羥基和羧基，對(duì)過(guò)渡金屬離子具有較強(qiáng)的絡(luò)合作用，終止了自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而對(duì)自由基顯示出較強(qiáng)的清除作用。另外，一般認(rèn)為，高級(jí)結(jié)構(gòu)呈螺旋狀的多糖活性較高，而呈可拉伸帶狀或皺紋型帶狀的多糖活性一般較低甚至沒(méi)有活性，三股螺旋構(gòu)型是多糖最具活性的空間構(gòu)象，而有報(bào)道發(fā)現(xiàn)茶多糖在水溶液中以有序的螺旋構(gòu)象存在，這是否是茶多糖具有抗氧化活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，有待進(jìn)一步深人研究。
3結(jié)論
1）用微波輔助提取鐵觀音茶多糖，通過(guò)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)對(duì)微波處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，影響得率的因素主次順序是：微波功率>料液比>微波時(shí)間>水浴浸提溫度；確定最佳的提取工藝條件為：微波功率375w，微波時(shí)間180s，水浴浸提溫度60℃，料液比1：30。
2）抗氧化活性結(jié)果表明，鐵觀音茶多糖對(duì)o2ˉ·和·oh有較好的清除效果，其清除能力與多糖質(zhì)量濃度有明顯的量效關(guān)系，實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的微波處理對(duì)其抗氧化活性無(wú)顯著影響（p>0.05）。
3）與傳統(tǒng)多糖提取技術(shù)相比，微波輔助提取技術(shù)可以大大縮短提取時(shí)間，具有節(jié)能、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，并且，適量的微波處理對(duì)茶多糖的抗氧化活性并無(wú)明顯影響。