小動(dòng)物活體成像技術(shù)（in vivo imaging technology）是利用高靈敏度的光學(xué)檢測(cè)儀器直接檢測(cè)動(dòng)物活體體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為研究的一類(lèi)技術(shù)，是近年來(lái)發(fā)展最快的生命科學(xué)研究方法，是最直接觀察細(xì)胞和分子在體內(nèi)行為的新興技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域[1]。
活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像主要采用生物發(fā)光與熒光發(fā)光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是利用熒光素酶報(bào)告基因在活體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的熒光蛋白與體外注射的熒光素底物發(fā)生化學(xué)反映產(chǎn)生熒光。而熒光發(fā)光成像技術(shù)是將熒光物質(zhì)或熒光物質(zhì)標(biāo)記的小分子物質(zhì)如基因、細(xì)胞也可是小分子藥物、抗體、納米材料等導(dǎo)入到活體體內(nèi)，通過(guò)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)的激發(fā)光源激發(fā)熒光集團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生波長(zhǎng)較激發(fā)光長(zhǎng)的發(fā)射光，然后通過(guò)高靈敏度制冷ccd 鏡頭探測(cè)到活體內(nèi)的發(fā)射光。通過(guò)活體成像技術(shù)可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、炎癥的發(fā)生、特定基因的表達(dá)和藥物作用效果等生物學(xué)過(guò)程。
本期小愛(ài)主要為大家介紹小動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)中常用的熒光染料及文獻(xiàn)研究思路！
d-熒光素abs42017256
d-熒光素是螢光素酶的底物，在鎂離子存在下熒光素酶使熒光素與atp反應(yīng)，發(fā)出黃綠色的光?？膳c小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)配套使用，用于體內(nèi)活體熒光檢測(cè)。
應(yīng)用案例：子宮內(nèi)膜癌腹膜轉(zhuǎn)移異種移植模型的研究[2]
首先構(gòu)建含il-37bδ1-45或nc的cv146/熒光素酶慢病毒載體，感染篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞(isk-lv-il37b、δ1-45和isk-lv-nc)。然后將穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞腹腔注射到小鼠體內(nèi)建立子宮內(nèi)膜癌腹膜轉(zhuǎn)移模型。
飼養(yǎng)38天后，對(duì)所有小鼠腹腔注射底物d-熒光素(abs42017256)。10分鐘后，小鼠腹腔注射0.3%戊ba比妥鈉溶液。5分鐘后，使用體內(nèi)成像系統(tǒng)光譜對(duì)小鼠進(jìn)行體內(nèi)生物發(fā)光成像（圖1）。然后處死小鼠，取出器官(肝、肺和腎)進(jìn)行成像。取部分腫瘤及上述臟器用福爾馬林固定，石蠟包埋，其余冰凍于?80°c進(jìn)行he染色、免疫組化染色、免疫印跡。
圖1 il-37b抑制子宮內(nèi)膜癌腹膜轉(zhuǎn)移異種移植瘤模型的研究[2]（abs42017256d-熒光素）
dir 碘化物abs45153692
dir 碘化物是一種親脂性的熒光染料，經(jīng)常用來(lái)染細(xì)胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)。由于dir的近紅外熒光可以穿透細(xì)胞和組織，因此在小動(dòng)物活體成像技術(shù)中也經(jīng)常使用。
應(yīng)用案例：用dir標(biāo)記納米膠束，評(píng)價(jià)膠束的腫瘤靶向性以阻止缺氧腫瘤的耐藥和轉(zhuǎn)移[3]
采用薄膜分散法制備殼寡糖(cos)包被、唾液酸(sa)受體靶向的順鉑(cddp)和一氧化氮(no)共載體納米膠束(ctp/cddp)，并用dir標(biāo)記膠束，然后利用體內(nèi)成像系統(tǒng)評(píng)價(jià)ctp/cddp/dir的腫瘤靶向性。如圖2a所示，游離dir在注射后經(jīng)歷了快速的藥物代謝和血液循環(huán)清除，在腫瘤內(nèi)幾乎檢測(cè)不到其熒光信號(hào)。dir標(biāo)記的ctp/cddp膠束給藥后3h，腫瘤組織內(nèi)可見(jiàn)明顯的熒光，且熒光強(qiáng)度隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。
具有智能靶向性的ctp/cddp膠束增加了細(xì)胞對(duì)cddp的攝取，增強(qiáng)了對(duì)腫瘤的細(xì)胞毒性，但降低了對(duì)正常器官或組織的全身毒性。在抗腫瘤機(jī)制方面，ctp/cddp通過(guò)下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α、谷胱甘肽2、多藥耐藥相關(guān)蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)，減少順鉑外流，抑制腫瘤上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而逆轉(zhuǎn)缺氧腫瘤細(xì)胞的耐藥和轉(zhuǎn)移。
圖2 dir標(biāo)記抗腫瘤納米膠束在小鼠體內(nèi)示蹤腫瘤組織[3]（abs45153692dir 碘化物）
此外，用于生物標(biāo)記的cyanine 7.5（一種發(fā)近紅外熒光的花青素?zé)晒馊玖希┯捎谄錈晒獠ㄩL(zhǎng)很長(zhǎng)，發(fā)射峰（em max）大于 800nm，恰好處于肌體組織近紅外窗口i的區(qū)域（肌體的血液，體液和組織此區(qū)域背景熒光弱，而長(zhǎng)波長(zhǎng)穿透性強(qiáng)），所以 cy7.5 的標(biāo)記物也常應(yīng)用于小動(dòng)物活體體內(nèi)成像。
參考文獻(xiàn)：
[1] ntziachristos v. going deeper than microscopy：the optical imaging frontier in biology[j]. nature methods，2010,7(8):603-614.
[2] wang x, wei z, tang z, et al. il-37bδ1-45 suppresses the migration and invasion of endometrial cancer cells by targeting the rac1/nf-κb/mmp2 signal pathway[j]. laboratory investigation [2023-06-12]. doi:10.1038/s41374-021-00544-2.
[3] chen y, fang l, zhou w, et al. nitric oxide-releasing micelles with intelligent targeting for enhanced anti-tumor effect of cisplatin in hypoxia.[j].journal of nanobiotechnology, 2021(1).doi:10.1186/s12951-021-00989-z.
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