整體分子量測定是蛋白質藥物產(chǎn)品（如單 抗）研發(fā)與質控中常進行的分析項目，而 esi-orbitrap ms（電噴霧離子化-靜電場軌道阱 質譜）已經(jīng)成為常用的測量方法之一。而 另一種常見質譜技術maldi—tof（基質輔助 激光解析-飛行時間質譜）無法進行此項分析， 其原因是由于：在maldi條件下，蛋白將主要 形成單電荷離子，而目前的tof型質譜 在高質荷比范圍分析中（10萬m/z以上范圍）， 分辨率也僅有數(shù)千。因此當面對質量巨大的 蛋白質藥物離子時（如單抗分子量近15萬）， tof分辨率明顯不足，不但無法進行分子量的 測定，甚至連單抗的糖型也根本無法辨 別（圖1）。在esi（電噴霧離子化）條件下， 蛋白分子將攜帶多電荷，以單抗為例，其將 攜帶40-70 個左右的電荷，信號落入2500- 3500m/z 范圍內 。 在此質荷比區(qū)域內 ， orbitrap質譜儀分辨率可達幾萬，因此可從容進行此 項分析。
實驗時，蛋白首先在液相色譜 中通過c4反相色譜柱進行脫鹽，然后在電噴霧離子源實現(xiàn)蛋白離子化，離子化的蛋白進 入質譜，產(chǎn)生原始質譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)將通過去 卷積軟件計算出蛋白質的質量。與tof原理完 全不同，orbitrap采用傅里葉變換進行離子質 量分析，在低質荷比區(qū)域，其分辨率可達40 萬以上，而tof分辨率僅為數(shù)千。在2000- 4000m/z范圍，兩者分辨率近似，但由于原理 的不同，orbitrap更易于實現(xiàn)基線分離——也 就是說即使在分辨率一致的情況下，相比tof， orbitrap可獲得更為清晰的質譜原始數(shù)據(jù)（圖2） [1-3] 。高質量的原始數(shù)據(jù)為分析結果提供了保 證。在完整單抗分析中，orbitrap準確度一般 為10ppm內（以單抗分子量15萬計算，10ppm 約相當于1.5da），而tof為20-30ppm左右。 orbitrap不僅準確度高，更由于在硬件中伴有 離子蓄積設計，而使靈敏度更高（tof質譜受 到分析原理的局限，不能大量蓄積離子分析， 在一定程度上影響了其靈敏度）。在圖3中， orbitrap數(shù)據(jù)清晰地顯示出單抗9種不同的糖型 組合，主要峰的質量誤差在10ppm之內。
圖1：單抗全分子量原始質譜圖對比，左為maldi-tof，右為esi-orbitrap數(shù)據(jù)。其中在對高質 荷比離子進行采集時，由于靈敏度原因，tof只能采用離子的線性飛行模式（此模式下分辨率 僅為數(shù)千），而無法采用分辨率更高的反射飛行模式（分辨率可達5萬）。
在單抗類藥物中，抗體-化學藥物偶聯(lián)物 （ antibody-drug conjugate, adc）利用抗體對 靶細胞的特異性結合能力，輸送高細胞毒性 化學藥物，來實現(xiàn)對癌變細胞的有效殺傷。 目前，經(jīng)fda已批準上市的adc藥物有三種， 分別為mylotargtm、adcetristm，kadcylatm，分 別治療急性髓系白血病，霍奇金淋巴瘤，以 及her2陽性的轉移性乳腺癌。全分子量測量 技術也可用于 adc 藥物的 dar （ drug to antibody ratio）值分析。圖4為某adc藥物去 糖基化后，orbitrap分析結果，其中偶聯(lián)了不 同數(shù)量化學藥物的質譜信號清晰明確，有利 于準確計算dar值（圖4中，未標示的峰為 free linker信號）。
在orbitrap平臺上還具有一項*的分析 方法——top down（*而下）技術。top down是在完整蛋白的狀態(tài)下，直接對蛋白整 體進行碎裂，通過碎片分析獲得蛋白結構信息（圖5）。在蛋白藥物分析中，可用于電荷 異質性分析的快速方法開發(fā)，以及肽圖序列 信息驗證。
木瓜蛋白酶及還原快速處理后的，分子量約 為2.5萬da的重鏈fab與輕鏈fab部分進行分子 質量測量時，原始質譜數(shù)據(jù)可實現(xiàn)同位素分 辨，因而可進行同位素質量計算（在全單抗 分子下，目前各種類型質譜數(shù)據(jù)僅可做平均 分子量測算）。同位素質量精度較平均分子 量更為。在圖6中，單抗重鏈fab與輕鏈 fab的分析準確度分別達到了驚人的2.7ppm與 0.9ppm（以da計算，質量誤差約在小數(shù)點后 第二位）。如前所述，加之top down提供的 豐富的碎片信息，此項技術被用于可用于電 荷異質性分析的快速方法開發(fā)，以及肽圖序 列信息快速驗證工作[3] 。
基于orbitrap的全分子量分析工作，可在 數(shù)分鐘內完成。但事實上，這項看似簡單的 分析工作，卻蘊含了對質譜準確性、分辨率、 靈敏度、穩(wěn)定性的多項挑戰(zhàn)，卻也正好是 orbitrap強大性能的集中體現(xiàn)。orbitrap系列質譜也正是基于這樣的品質，為其使用者提供 了有力的技術保證。