本文摘自和光純藥時報 vol.87 no.4（2019年10月號），由麻布大學獸醫(yī)學部 解剖第二研究室 小澤秋沙執(zhí)筆撰寫。
本法是一種可使臨床檢查或研究中應用廣泛的組織化學染色蘇木精-伊紅（he）或masson法（mt）染色的組織切片脫色，并可重新用于其他染色的方法。
迄今為止，每一種組織化學染色通常都需要使用至少一片組織切片，因此必須準備與組織化學染色方法相對應數(shù)量的組織切片。然而，由于制備組織切片時的技術(shù)熟練度以及組織樣品狀態(tài)、大小等原因，有時很難備齊多個適合評價的組織切片。另外，在評價同一細胞時一般使用連續(xù)切片的方法，然而即使獲得了合適的連續(xù)切片，想要觀察的組織結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，也可能不同時存在于兩個相鄰的組織切片上。
在這種情況下，重復利用已有觀察特征的細胞或結(jié)構(gòu)的組織切片就會十分有用。he染色可獲取組織大致特征，因此是*染色的代表染色法之一，如果可以對he染色后的目標結(jié)構(gòu)的組織切片進行重新染色，便可以提高臨床檢查以及研究結(jié)果的準確性。
至今為止，組織切片脫色通常使用乙醇與鹽酸的混合溶液、含有草酸、*的溶液。然而，這些脫色方法都會影響組織切片在脫色后的再染色效果。
實際上，在乙醇中加入鹽酸的溶液不能對蘇木精等染料充分脫色。而通過*、草酸脫色則會對組織切片造成很大的損害，重新染色時組織結(jié)構(gòu)可能會因為切片剝離被破壞，從而限定了再染色的方法，也限制了組織切片的再利用。因此，學界期待開發(fā)一種幾乎不會損害組織切片，并且可以對多種染色法進行脫色后再染色的全新方法。
這次，fujifilm wako開發(fā)的decolorizing solution，可以對he染色后確認了組織狀態(tài)（特定的結(jié)構(gòu)及細胞的存在）的切片脫色，再重新用于其他染色，從而能夠從同一組織切片中獲得更多信息。該方法的特點在于可以對原本難以脫色的蘇木精、鐵蘇木精進行脫色。
使用方法：首先將染色后密封的載玻片標本浸入二甲苯等有機溶劑中，直至蓋玻片自然剝落。請注意，在此過程中若是強行分離蓋玻片可能會破壞組織切片。
另外，若在組織切片上仍然殘留有封固劑的狀態(tài)下就進行下一步驟，水溶性色素在水合后不會脫落，會降低隨后使用decolorizing solution進行脫色的效果，因此必須使用二甲苯等有機溶劑充分浸泡。必須注意的是，標本越舊，封固劑的固化越牢固，封固劑就越難去除。
其次，將組織切片依次用各種濃度的乙醇進行水合，后浸入蒸餾水中。在水合過程中，伊紅等水溶性色素基本脫色，組織切片上僅殘留染色的蘇木精。將殘留蘇木精染色的組織切片浸入按照使用濃度稀釋的decolorizing solution 1中。脫色主要取決于組織切片染色后保存的時長，但蘇木精在室溫下于decolorizing solution 1中浸漬1 h基本就能脫色。
鐵蘇木精脫色時需要在decolorizing solution 1中浸漬1 h后使用蒸餾水清洗3次，然后浸漬于decolorizing solution 2。通過光學顯微鏡確認脫色程度（染色殘留情況），確認不會影響下次染色后，浸漬于蒸餾水并清洗3次，這時可用于重新染色。
目前，在使用decolorizing solution脫色后，可以使用的再染色方法已確認的有he染色、pas染色、mt染色和免疫組織化學染色。
圖1和圖2分別是小鼠海馬體以及肝臟在he染色后使用decolorizing solution按照上述步驟脫色后的圖片。如圖１a及圖２a所見，包括細胞核在內(nèi)，被蘇木精染色的部分在圖1b及圖2b中大部分已被脫色。
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圖1. 使用decolorizing solution 1脫色he 染色后的組織切片并重新染色
a：he染色的小鼠海馬體組織圖像
b：使用decolorizing solution 1脫色后與a相同位置的組織圖像
c：脫色后使用抗iba1抗體進行熒光免疫組織化學染色后與a和b相同位置的組織圖像
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圖2. 使用decolorizing solution 1脫色he 染色后的組織切片并重新染色
a：he染色的小鼠肝臟組織圖像
b：使用decolorizing solution 1脫色后與a相同位置的組織圖像
c：脫色后使用抗pcna抗體進行免疫組織化學染色后與a和b相同位置的組織圖像
另外，圖3為小鼠肝臟以及腎臟在mt染色后使用decolorizing solution 1和2脫色后的圖像。圖3a和c中包括細胞核在內(nèi)，被鐵蘇木精染色的大部分在圖3b和d中均已*脫色。
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圖3. 使用decolorizing solution 1和2對mt 染色后的組織切片脫色
a：mt染色后的小鼠肝臟組織圖像
b：使用decolorizing solution 1和2脫色后與a相同位置的組織圖像
c：mt染色后的小鼠腎臟的組織圖像
d：使用decolorizing solution 1和2脫色后與c相同位置的組織圖像
圖1c為小鼠海馬體脫色后使用抗iba1抗體（fujifilm wako pure chemical corporation）進行免疫組織化學染色的圖片，圖1a和b為同一位置的圖像。如圖可見，脫色后的海馬體切片仍然可以檢測出iba1陽性小膠質(zhì)細胞突起。圖2c為小鼠肝臟脫色后使用抗pcna抗體進行免疫組織化學染色的圖片。如圖可見，陽性pcna主要在肝細胞的細胞核中表達。
另外，并未發(fā)現(xiàn)因脫色導致的組織切片破壞等損傷。
該方法的優(yōu)點在于，大量*保存在大學、研究所、醫(yī)院等的*組織切片，在制備時沒有新型染色方法以及針對新型抗原的抗體，通過再染色等方法可以重新評價以獲取新的實驗信息。
目前，decolorizing solution的應用只適用于he 染色和mt 染色后的脫色，但隨著該方法的應用范圍拓展，脫色法在重復使用組織切片方面的實用性將進一步提高。
◆產(chǎn)品列表
產(chǎn)品編號產(chǎn)品名稱規(guī)格包裝
043-34561 decolorizing solution 1 病理研究用 250 ml
046-34551 decolorizing solution 2 病理研究用 250 ml
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