β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-ga)活性檢測(cè)試劑盒（微量法）
產(chǎn)品貨號(hào)：ba1932
產(chǎn)品規(guī)格：100t/48s
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
β-1,3-ga( ec 3.2.1.73)主要存在植物中，催化 β-1,3-葡萄糖苷鍵水解。在植物染病或處于其他逆境條件下，可 誘導(dǎo)細(xì)胞大量合成β-1,3-ga，因此β-1,3-ga活性測(cè)定廣泛應(yīng)用于植物病理和逆境生理研究。
β-1,3-ga水解昆布多糖，內(nèi)切β-1,3-葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生還原末端，通過(guò)測(cè)定還原糖生成速率，來(lái)計(jì)算其酶活性。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
產(chǎn)品組成：
試劑名稱
規(guī)格
保存條件
提取液
液體100ml×1瓶
2-8℃
試劑一
粉劑×2支
2-8℃
試劑二
液體30ml×1瓶
2-8℃
標(biāo)準(zhǔn)品
粉劑×1支
2-8℃
溶液的配制：
1.試劑一：臨用前取1支加1ml蒸餾水溶解，用不完的試劑2-8℃保存4周；
2.標(biāo)準(zhǔn)品：10mg無(wú)水葡萄糖。臨用前加入1ml蒸餾水溶解，配制成10mg/ml葡萄糖溶液備用，2-8℃保存2周。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1.組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2.細(xì)菌或細(xì)胞：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200w超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；12000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟
1.分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。
2.標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：將標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋至1、0.8、0.6、0.4、0.2mg/ml。
3.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表。
序號(hào)
稀釋前濃度（mg/ml）
標(biāo)準(zhǔn)液體積（µl）
蒸餾水體積（µl）
稀釋后濃（mg/ml）
1
10
100
900
1
2
1
160
40
0.8
3
1
120
80
0.6
4
1
80
120
0.4
5
1
40
160
0.2
實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需35µl標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4.樣本測(cè)定（在1.5ml ep管中依次加入下列試劑）：
試劑名稱（μl）
測(cè)定管
對(duì)照管
標(biāo)準(zhǔn)管
空白管
樣本
35
35
-
-
標(biāo)準(zhǔn)液
-
-
35
-
蒸餾水
-
35
35
70
試劑一
35
-
-
-
充分混勻，放入37℃水浴60min。
試劑二
230
230
230
230
充分混勻，沸水浴5min（蓋緊，防止水分散失），流水冷卻，取200μl至微量玻璃比色皿或96孔板中，540nm 處記錄各管吸光值a，δa=a測(cè)定-a對(duì)照?？瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)曲線只需做1-2次。
如果吸光值大于2，可以用提取液對(duì)樣本稀釋后測(cè)定。
三、β-1,3-ga活性計(jì)算
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管吸光度 x（a標(biāo)準(zhǔn)管-a空白管）和濃度（y，mg/ml）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將δa帶入公式中計(jì)算出樣本中產(chǎn)生的還原糖的含量y值（mg/ml）。
2.β-1,3-ga活性計(jì)算：
（1）按蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每小時(shí)產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。
β-1,3-ga (u/mg prot)=(y×v1)÷(v1×cpr)÷t=y÷cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算 單位的定義：
每g組織每小時(shí)產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。
β-1,3-ga (u/g 質(zhì)量)=(y×v1)÷(w×v1÷v2)÷t=y÷w
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌每小時(shí)產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。
β-1,3-ga (u/104 cell)=( y×v1)÷(500×v1÷v2)÷t=0.002×y
v1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.035ml；v2：加入提取液體積，1ml；cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；w： 樣本質(zhì)量，g；t：反應(yīng)時(shí)間，60min=1h；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，萬(wàn)。