霍夫曼調(diào)制對比度已經(jīng)成為觀察未染色，低對比度生物樣本的標(biāo)準(zhǔn)。其創(chuàng)新的技術(shù)實施可大大簡化操作，并具有更大的部署靈活性。將調(diào)制器集成在現(xiàn)代倒置顯微鏡的光路中，可以使用多種明場或相位物鏡，而無需選擇特殊物鏡?，F(xiàn)在，可以使用可自由訪問的調(diào)制器分別修改和優(yōu)化對比度。
調(diào)制對比調(diào)制對比度是寬視野顯微鏡中的一種對比度增強(qiáng)方法，可以將未染色樣本和活細(xì)胞中的光學(xué)梯度或斜率轉(zhuǎn)換為變化的光強(qiáng)度。它是由羅伯特·霍夫曼（robert hoffman）于1975年發(fā)明的，它采用狹縫板實現(xiàn)傾斜照明，并采用調(diào)制器進(jìn)行光強(qiáng)度調(diào)制。由于標(biāo)本的三維外觀，調(diào)制對比技術(shù)在醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)中的主要應(yīng)用是顯微操作技術(shù)，例如ivf中的icsi（胞漿內(nèi)精子注射）以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的克隆和原核注射。
光路中的特殊組件調(diào)制對比照明需要光路上至少有兩個特殊組件。為了實現(xiàn)傾斜照明，在聚光鏡的前焦平面上放置了一塊狹縫板。其次，將調(diào)制器放置在物鏡的后焦平面中。調(diào)制器包含三個具有不同光密度的區(qū)域：一個透明區(qū)域，一個具有15％的光許可和一個具有1％的光許可的區(qū)域。根據(jù)定義，通過調(diào)制器的光稱為已調(diào)制。
除了上述組件之外，在滑板中通常還可以找到一個包含偏振片的第二縫隙。與位于顯微鏡聚光鏡頂部的另一個偏振器結(jié)合使用，該偏振器可用于控制有效的狹縫開口（通過打開90°（暗）位置）并實現(xiàn)浮雕效果。請注意，樣品不位于偏振片之間，因此可以使用雙折射塑料或玻璃容器。但是，偏振片不是調(diào)制對比度的先決條件。
圖1：聚光鏡的光線通過狹縫板的狹縫以傾斜照明。當(dāng)光線通過樣本時，光線在相變處發(fā)生偏轉(zhuǎn)（例如質(zhì)膜的斜率發(fā)生變化）。隨后，光被偏轉(zhuǎn)到調(diào)制器的不透明或透明部分，從而產(chǎn)生浮雕狀的三維圖像印象。
圖2：當(dāng)光通過調(diào)制器的不同區(qū)域時，其幅度被調(diào)制。通常，這些區(qū)域（從左到右）的透射率為1％，15％或100％。
調(diào)制對比度將相位梯度轉(zhuǎn)換為亮度梯度細(xì)胞的許多成分通過其固有特性引起透射光的相位變化。這些屬性可能是特定結(jié)構(gòu)的斜率和陡度，修改折射率變化率的結(jié)構(gòu)或者只是給定結(jié)構(gòu)的厚度變化的結(jié)構(gòu)。由于這些特性（例如，單元厚度）通常會在某個區(qū)域逐漸變化（而不是立即變化），因此該區(qū)域上的光相位也會逐漸發(fā)生變化，從而導(dǎo)致相位梯度。相位梯度將使入射光發(fā)生衍射，從而導(dǎo)致光的偏轉(zhuǎn)角發(fā)生變化。
由于調(diào)制對比度中采用了傾斜照明，因此偏轉(zhuǎn)角度的變化可能會受到很大影響，并且與非偏轉(zhuǎn)光相比，光將在不同區(qū)域通過調(diào)制器。在所得到的圖像中，以斜率，陡度，厚度等變化的程度或多或少均勻的單元區(qū)域?qū)@示為灰色。對于圖像的背景也是如此，因為通過這些同質(zhì)區(qū)域的光不會由于樣品中的相位梯度而經(jīng)歷相移，并且?guī)缀醪粫D(zhuǎn)。
在調(diào)制對比系統(tǒng)中，未偏轉(zhuǎn)的光以15％的光許可通過調(diào)制器中的區(qū)域，從而導(dǎo)致單元和背景的均勻區(qū)域呈灰色。當(dāng)光通過導(dǎo)致相移（例如，細(xì)胞膜斜率變化）的標(biāo)本區(qū)域時，光會偏轉(zhuǎn)到調(diào)制器的黑暗區(qū)域（允許1％）或透明區(qū)域（允許100％）。當(dāng)樣品傾斜照射時，圖像從漸變的一側(cè)顯得較暗（在允許1％的允許下，光被偏轉(zhuǎn)到該區(qū)域），而從漸變的另一側(cè)（該光線被偏轉(zhuǎn)到有1％的區(qū)域）顯得更亮。 100％的權(quán)限）。
圖3a，b：通過將相位梯度轉(zhuǎn)換為亮度梯度，調(diào)制對比度可視化了透明的低對比度樣本。結(jié)果，形成了高對比度的灰度級，產(chǎn)生了三維圖像的印象。（圖3a由德國gießen體外受精中心c. mehnert提供）
imc提供更多自由在使用集成調(diào)制對比度（imc）的情況下，調(diào)制器集成在物鏡外部的焦平面中，該焦平面與光束路徑中的聚光鏡（中間光瞳）共軛（圖4）。調(diào)制器安裝在滑架上，滑架插入到支架側(cè)面的瞳孔間接口中（圖5）。因此，它們是可自由訪問的，并允許用戶根據(jù)需要輕松調(diào)整對比度。除此之外，還可以使用具有不同傳輸?shù)恼{(diào)制器?；瑝K還具有用于未調(diào)制圖像的明場位置。已設(shè)置帶有imc的顯微鏡，以確保所有物鏡的對比度方向（3d壓印的陰影方向）相同。因此，當(dāng)改變物鏡或放大倍率時，標(biāo)本的空間印象保持不變，
圖4：leica microsystems倒置數(shù)碼顯微鏡中的imc解決方案。調(diào)制器可在物鏡外部自由訪問，并位于中間瞳孔中，可靈活調(diào)節(jié)。狹縫隔膜位于聚光鏡瞳孔中。
圖5：在兩個不同瞳孔位置帶有調(diào)制器盤的imc滑塊易于使用，并且可以進(jìn)行單獨調(diào)整。
解耦調(diào)制器時的基本考慮是，物鏡的后焦平面可以在45 mm共焦距離的整個范圍內(nèi)的任何位置。因此，物鏡外部的調(diào)制器必須至少可移動該距離。得益于徠卡物鏡的設(shè)計，該物鏡由固定焦平面，倒置顯微鏡中的展開以及從5x到63x的固定放大倍數(shù)確定，因此可以將調(diào)制平面的數(shù)量減少到兩個光瞳位置（圖6）。
到瞳孔圖像的光束路徑，即所謂的中間瞳孔，被設(shè)計為1x望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)。物鏡后面的無限光路在中間瞳孔中再現(xiàn)。結(jié)果，在不損害圖像的位置或質(zhì)量的情況下，任何厚度的平行于平面的光學(xué)調(diào)制器也可以在中間光瞳處插入光束路徑，傾斜或傾斜。通過觀察筒的單色和彩色校正以及imc調(diào)制器的氣相沉積灰色和深色金屬涂層的極低反射特性，可將雜散光和假光降至低。
圖6：徠卡物鏡由固定焦平面定義。由于它們在倒置顯微鏡中的使用以及由于5x-63x的固定放大倍率，可以將調(diào)制平面的數(shù)量減少到兩個光瞳位置。
個別可變參數(shù)imc為單獨調(diào)整調(diào)制對比度提供了很大的范圍。調(diào)制器可垂直調(diào)節(jié)，以始終提供均勻的圖像。因此，可以補償不同階段或緩沖溶液水平以及標(biāo)本皿內(nèi)細(xì)胞的不同位置。側(cè)向移動調(diào)制器會改變分辨率：調(diào)制器和狹縫光闌向外移動得越遠(yuǎn)，分辨率就越高（大分辨率res =λ\ 2na）。
有兩個調(diào)制器參數(shù)會影響對比度的強(qiáng)度：透射率和灰色區(qū)域的寬度。降低透射率會增加對比度。例如，25％的透射率可產(chǎn)生平滑的對比度。值為10％左右時，對比度會變得更加清晰。改變調(diào)制器寬度同樣有效（圖7）。
圖7：橫向可調(diào)的調(diào)制器，分辨率可變，狹縫光闌帶有額外的偏振狹縫，可調(diào)節(jié)浮雕效果。
縮小灰色區(qū)域可產(chǎn)生更清晰的對比度，而寬的調(diào)制器則可以減輕整體圖像的印象。imc的裂膜具有兩個開口。狹縫成像在調(diào)制器的灰色區(qū)域，從而產(chǎn)生用于調(diào)制對比度的傾斜照明。第二個狹縫被偏振箔覆蓋（圖7）。位于光圈前面的可旋轉(zhuǎn)偏振片可以增加或減少調(diào)制對比度的3d效果。使用塑料皿時，偏振器不會影響圖像質(zhì)量，因為光僅在照明側(cè)偏振，而在物鏡側(cè)不使用檢偏鏡。狹縫隔膜的尺的聚光鏡相匹配。
因此，imc不僅適用于生物材料的常規(guī)檢查，而且還是要求苛刻的應(yīng)用（如顯微操作，顯微注射或顯微解剖）的出色工具。
imc的優(yōu)勢許多優(yōu)點使集成調(diào)制對比度成為廣域顯微鏡中廣泛使用的方法。集成的調(diào)制對比度允許使用放大倍數(shù)高達(dá)63倍的物鏡。不需要特殊的物鏡，可以將具有較高校正度的物鏡（例如，平消色差和復(fù)消色差物鏡）用于調(diào)制對比度。這樣可以提供出色的分辨率，并具有良好的對比度和可見度
調(diào)制對比顯微鏡的另一個優(yōu)點是，與微分干涉對比顯微鏡不同，可以使用塑料容器和皿，因為光路中的偏振器位于樣品之前。此外，不需要沃拉斯頓棱鏡。這為配備調(diào)制對比度的顯微鏡帶來了適中的成本。