bca蛋白定量試劑盒使用說明書
【產(chǎn)品組成】
component
sbj-1001s
250t
sbj-1001m
500t
store at
試劑(a):bca試劑a
50ml
100ml
室溫,避光
試劑(b):bca試劑b
1.5ml
3ml
室溫
試劑(c):蛋白標(biāo)準(zhǔn)(bsa)
20mg
20mg
室溫
試劑(d):蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液
5ml
10ml
室溫
【保存條件】
室溫,避光,6個月
【產(chǎn)品概述】
目前世界上常用的蛋白濃度檢測方法是：bca蛋白定量試劑盒(bcaproteinassaykit)和bradford蛋白定量試劑盒(bradfordproteinassaykit)。bca法與傳統(tǒng)方法相比，更簡單、更穩(wěn)定、更靈敏度。bca法測定蛋白濃度兼容性亦很好，不受大部分樣本中其他成分的影響，對于5%以內(nèi)的sds、tritonx-100、tween20、tween80具有很好的兼容性,但bca法測定蛋白濃度易受螯合劑、高濃度的還原劑等的影響，在bca法測定蛋白濃度前應(yīng)盡量使：edta濃度≤m10m，dtt濃度≤1mm，2-me≤0.01%。
bcaproteinassaykit在50～1000μg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，其小檢出量為25μg/ml。本試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。
【使用方法】
1、取1ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液*加入到含有20mg的蛋白標(biāo)準(zhǔn)(bsa)中，充分溶解，后配制成20mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制后可立即使用，配制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)-20℃保存。
2、取適量的20mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至終濃度為500μg/ml或所需濃度。如取25μl20mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)，加入975μl稀釋液，充分混勻，即配制成500μg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。特別提示：待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中，例如待測蛋白溶解于蔗糖中，亦取20mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶解于蔗糖中。一般也可以用0.9%nacl或pbs作為溶解bsa稀釋液，稀釋后的500μg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液也應(yīng)-20℃長期保存。
3、根據(jù)樣品數(shù)量，按試劑(a):試劑(b)=50:1的比例配制bca工作液，即取50份bca試劑a和1份bca試劑b，充分混勻，即獲得bca工作液。例如取5mlbca試劑a和0.1mlbca試劑b，配制成5.1mlbca工作液，bca工作液室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。
4、將500μg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板或ep管中，加稀釋液補足至20μl，其蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500μg/ml。
5、加20μl待測蛋白到96孔板或ep管中，如果樣本不足20μl，用稀釋液補足至20μl。注意：如果標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與溶解待測蛋白的溶液不同，應(yīng)在待測蛋白中加入20μl稀釋液；如果標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與溶解待測蛋白樣本的溶液相同，無需在待測蛋室溫白樣本孔中加入20μl稀釋液，以減少不同溶液的差異。
6、各孔或管加入200μl配制好的bca工作液，37℃孵育20～30min。
7、酶標(biāo)儀或分光光度計測定562nm波長處吸光度(如無562nm，540～595nm之間的波長也可)，各孔或管吸光度減去用未加500μg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以求得的差值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)孔或管中蛋白濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品的蛋白濃度。
【注意事項】
1、蛋白標(biāo)準(zhǔn)(bsa)粉末溶解于蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液后，即獲得蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液，該原液中含有防腐劑，不影響后續(xù)檢測，該蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液-20℃長期保存。
2、待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中，否者待測蛋白與蛋白標(biāo)準(zhǔn)中所含非蛋白成分不一致，有可能導(dǎo)致測定不準(zhǔn)確。
3、如果檢測效果不佳，可以室溫放置2h或60℃放置30min，顏色會隨著時間的延長不斷加深。顯色反應(yīng)也會隨溫度升高而加快；如果濃度較低，可以適當(dāng)延長孵育時間或在較高溫度下孵育。
4、測定標(biāo)準(zhǔn)曲線時發(fā)現(xiàn)隨著標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加吸光度或顏色沒有明顯變化，可能的原因是樣品中含有嚴(yán)重干擾bca法測定蛋白濃度的物質(zhì)。
5、bca法檢測中樣本中不應(yīng)含有egta，否則影響檢測結(jié)果。
6、因bca法測定時顏色會隨著時間的延長不斷加深，建議每次測定時都做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且顯色反應(yīng)的速度和溫度有關(guān)，所以除非控制顯色反應(yīng)的時間和溫度，否則每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7、如果沒有酶標(biāo)儀，也可以使用普通分光光度計測定，但應(yīng)考慮根據(jù)比色皿的小檢測體積。應(yīng)按比例適當(dāng)加大bca工作液的用量使總體積不小于小檢測體積，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的用量亦相應(yīng)按比例放大；使用分光光度計測定蛋白濃度時，可以測定的樣品數(shù)量可能會顯著減少。
8、為了加快bca法測定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)加熱，但是切勿過熱，否則易失效。