范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)品中*、磺胺甲基嘧啶、*和磺胺甲基異噁唑殘留量的液相色譜測(cè)定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)品中*、磺胺甲基嘧啶、*和磺胺甲基異噁唑殘留量的測(cè)定，其它磺胺類藥物的測(cè)定可以參照本標(biāo)準(zhǔn)。
規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的版本。凡是不注日期的引用文件，其新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
gb/t6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
原理
用乙酸乙酯提取，*反提取，正己烷脫脂，熒光胺衍生，反相色譜柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，磺胺5-甲氧嘧啶為內(nèi)標(biāo)物，內(nèi)標(biāo)法定量。
試劑
本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑在磺胺類藥物出峰處應(yīng)無(wú)干擾峰，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合gb/t6682中一級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)。
標(biāo)準(zhǔn)品：*、磺胺甲基嘧啶、*、磺胺甲基異噁唑，磺胺5-甲氧嘧啶，純度均大于98.0%。
丙酮：色譜純。
正己烷：色譜純。
乙酸乙酯：色譜純。
乙腈：色譜純。
甲醇：色譜純。
熒光胺：純度大于99.0%。
乙酸鈉：分析純。
冰乙酸：優(yōu)級(jí)純。
鹽酸溶液：2mol/l，量取180ml鹽酸，加適量水并稀釋至1000ml。
乙酸鈉溶液：3.5mol/l，稱取28.7g無(wú)水乙酸鈉溶于蒸餾水中，定容至100ml。
熒光胺溶液：2mg/l，稱取0.03g熒光胺，加15ml丙酮，振搖至*溶解，存放在暗處?，F(xiàn)配現(xiàn)用。
標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：100mg/l，稱取標(biāo)準(zhǔn)品10mg(稱準(zhǔn)至0.1mg)，用甲醇溶解并定容至100ml。避光冷藏保存，保存期為一個(gè)月。
混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：1mg/l，移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1.00ml，用甲醇稀釋并定容至100ml，在室溫下混勻。
內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：100mg/l，稱取磺胺5-甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品10mg(稱準(zhǔn)至0.1mg)，用甲醇溶解并定容至100ml。避光冷藏保存，保存期為一個(gè)月。
內(nèi)標(biāo)中間液：1mg/l，移取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液1.00ml，用甲醇稀釋并定容至100ml，在室溫下混勻。
混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液20μl、40μl、100μl、200μl、400μl，分別加入內(nèi)標(biāo)中間液100μl，用2mol/l鹽酸(4.10)稀釋至2ml，配成濃度分別為0.01mg/l、0.02mg/l、0.05mg/l、0.10mg/l、0.20mg/l的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，其中內(nèi)標(biāo)濃度為0.05mg/l。
儀器與設(shè)備
液相色譜儀：配熒光檢測(cè)器。
電子天平：感量0.0001g。
電子天平：感量0.01g。
高速組織搗碎機(jī)。
均質(zhì)機(jī)。
離心機(jī)。
旋渦混勻器。
氮吹儀。
往復(fù)式振蕩器。
聚丙烯離心管：15ml、50ml。
容量瓶：10ml、20ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml。
玻璃移液管：1ml、2ml、5ml、10ml。
巴斯德吸管。
色譜條件
色譜柱：ods-c18，5μm，4.6mm×250mm，或同類型號(hào)色譜柱。
柱溫：45℃。
流動(dòng)相：乙腈 乙酸溶液(38 62)，500ml水中加入冰乙酸調(diào)節(jié)ph至3.0配制成乙酸溶液。
流速：1ml/min
進(jìn)樣量：20μl。
激發(fā)波長(zhǎng)：405nm。
發(fā)射波長(zhǎng)：495nm。
步驟分析
樣品制備
從原始樣品中取出部分有代表性的樣品，高速組織搗碎機(jī)搗碎。四分法縮分出不少于500g樣品，混勻，均分成兩份。裝入清潔容器，加封，標(biāo)明標(biāo)記。-18℃以下冷凍保存。
提取
將樣品解凍，稱取2.00g，置于50ml聚丙烯離心管，加入磺胺5-甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)中間液(4.16)100μl，用玻璃棒攪勻，再加乙酸乙酯10ml，均質(zhì)機(jī)14000rpm均質(zhì)1min，往復(fù)式振蕩器振動(dòng)10min，3000rpm離心10min，將乙酸乙酯層小心轉(zhuǎn)移到15ml具塞刻度試管中，40℃以下氮?dú)獯抵?ml。再向原離心管中加入乙酸乙酯10ml，旋渦混勻30s，振動(dòng)10min，3000rpm離心10min，將乙酸乙酯層小心轉(zhuǎn)移到原15ml具塞刻度試管中，40℃以下氮?dú)獯抵?ml。然后在試管中加入2.00ml2mol/l的鹽酸溶液，旋渦混勻1min，加蓋后振動(dòng)10min，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去乙酸乙酯層，在余液中加入正己烷5ml，旋渦混勻30s，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去正己烷層，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液備用。
衍生
向樣品瓶中加入200μl混合標(biāo)準(zhǔn)使用液或樣品提取液、200μl乙酸鈉溶液和80μl熒光胺溶液，旋渦混勻30s，20min后供液相色譜分析。
色譜分析
取衍生后的樣品提取液20μl進(jìn)樣，記錄峰面積，響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)法定量?；前奉愃幬锷V分析圖參見(jiàn)附錄a。
工作曲線
稱取空白樣品2.00g，分別添加混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(4.14)20μl、40μl、100μl、200μl、400μl，樣品中每種磺胺殘留量分別為0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.20mg/kg，按7.2、7.3、7.4操作，以磺胺峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，磺胺含量為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線。
計(jì)算
用色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按下式計(jì)算樣品中磺胺殘留量：
式中：
x——樣品中磺胺殘留量，單位為毫克每千克(mg/kg)；
s——樣品溶液中磺胺峰面積，單位為counts；
s1——樣品溶液中內(nèi)標(biāo)峰面積，單位為counts；
s——標(biāo)準(zhǔn)溶液中磺胺峰面積，單位為counts；
s1——標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)峰面積，單位為counts；
x——加標(biāo)樣品中磺胺殘留量，單位為毫克每千克(mg/kg)。
方法回收率
濃度范圍為0.010mg/kg～0.10mg/kg時(shí)，回收率見(jiàn)回收率表。
回收率表
名稱
回收率
*
88.0%～111.8%
磺胺甲基嘧啶
90.0%～110.8%
*
91.0%～110.1%
磺胺甲基異噁唑
107.0%～116.7%
方法檢出限
本方法檢出限為0.010mg/kg。
精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的15%。