1.玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時以上;
2.無菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈,紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時以上;
3.培養(yǎng)基(ph7.2)和血清配制好后要做無菌試驗(yàn):將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi),用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取*培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天,肉眼見無渾濁或沉淀等異物.分裝后置-20度保存;
4.消化液(ph7.8)或其它加入液,應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌,分裝成支置-20度保存;
5.培養(yǎng)箱應(yīng)先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線的應(yīng)照射1小時以上,如有高溫滅菌的應(yīng)按程序來菌).至少每月一次.
6.進(jìn)入操作時應(yīng)注意先清洗雙手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作時注意無菌臺內(nèi)空間層次.手及物品不要在暴露的瓶口上方來往,如果數(shù)量較多,培養(yǎng)瓶應(yīng)放在與酒精燈平行地方便于操作,瓶與瓶之間應(yīng)相隔一定的距離,開瓶(蓋)時應(yīng)先用75%酒精反復(fù)擦拭或用燈燒,開后應(yīng)用燈先燒口,然后燒蓋.用完后同樣操作.整個操作過程盡量在無菌臺靠里面一點(diǎn).
傳代:
1.貼壁細(xì)胞:
對于貼壁細(xì)胞應(yīng)先吸(倒)盡培養(yǎng)基,吸的越干凈越好,以免中和后加入的消化液,使強(qiáng)度減弱.50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約0.6ml,按此比例進(jìn)行消化,(根據(jù)配制強(qiáng)度經(jīng)驗(yàn)),晃動使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2分鐘,鏡下見細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落后,輕輕振動瓶底使細(xì)胞全部脫落,加入2-3ml*培養(yǎng)基后,輕輕吹打,使細(xì)胞基本成單個懸浮,然后分置其它無菌培養(yǎng)瓶內(nèi),加入*培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn).
2.懸浮細(xì)胞:
一般傳代可直接將細(xì)胞原液分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi),加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),如要高濃度可先離500rpm,5mi后加入*培養(yǎng)基,輕輕吹勻后,分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi)加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).
傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)：
1.嚴(yán)格的無菌操作
2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化 。