熒光是普遍存在的發(fā)光家族中的一員，其中敏感分子通過物理（例如光吸收），機械（摩擦）或化學(xué)機理所產(chǎn)生的電子激發(fā)態(tài)發(fā)光。通過由紫外光或可見光光子激發(fā)分子而產(chǎn)生發(fā)光是稱為光致發(fā)光的現(xiàn)象，其形式上分為兩類，熒光和磷光，這取決于激發(fā)態(tài)的電子結(jié)構(gòu)和發(fā)射路徑。熒光是某些原子和分子吸收特定波長的光的性質(zhì)，并且隨后在短暫的間隔后發(fā)射較長波長的光，稱為熒光壽命。磷光過程以類似于熒光的方式發(fā)生，但具有更長的激發(fā)態(tài)壽命。
熒光過程由三個重要事件決定，所有這些事件發(fā)生在相隔幾個數(shù)量級的時間尺度上（見表1）。由入射光子激發(fā)的敏感分子發(fā)生在飛秒（10e-15秒），而激發(fā)態(tài)電子到低能級的振動弛豫要慢得多，并且可以以皮秒（10e-12秒）來測量。后的過程是發(fā)射較長波長的光子并使分子返回到基態(tài)，發(fā)生在相當(dāng)長的納秒時間（10e-9秒）內(nèi)。盡管從激發(fā)到發(fā)射的整個分子熒光壽命僅在十億分之一秒內(nèi)測量，這種現(xiàn)象是光與物質(zhì)之間相互作用的一個驚人表現(xiàn)形式，構(gòu)成了穩(wěn)態(tài)和時間分辨熒光光譜和顯微鏡的擴展領(lǐng)域的基礎(chǔ)。由于熒光檢測的發(fā)射輪廓，空間分辨率和高特異性非常敏感，該技術(shù)正迅速成為遺傳學(xué)和細胞生物學(xué)中的重要工具。
幾位研究人員在十七世紀和十八世紀期間報告了發(fā)光現(xiàn)象，但卻是英國科學(xué)家george g. stokes爵士在1852年首先描述了熒光，并負責(zé)創(chuàng)造藍白色熒光礦物螢石（fluorespar）。斯托克斯也發(fā)現(xiàn)了波長轉(zhuǎn)換到以他的名字命名的發(fā)射光譜中更長的值。熒光是20世紀初期由幾位著名科學(xué)家*在光學(xué)顯微鏡中遇到的，其中包括augustköhler和carl reichert，他們初報告說熒光在紫外顯微鏡中是一種麻煩。臺熒光顯微鏡是由德國物理學(xué)家ottoheimstädt和heinrich lehmann在1911年至1913年間從紫外線儀器中衍生出來的。這些顯微鏡被用來觀察細菌，動物和植物組織中的自發(fā)熒光。此后不久，stanislav von provazek開始了一個新的時代，他使用熒光顯微鏡研究固定組織和活細胞中的染料結(jié)合。然而，直到20世紀40年代初期，albert coons開發(fā)了一種用熒光染料標(biāo)記抗體的技術(shù)，因此誕生了免疫熒光領(lǐng)域。到二十一世紀之交，熒光顯微鏡領(lǐng)域正在引起細胞生物學(xué)革命，將活細胞成像的能力與合成和基因編碼的熒光探針的高度特異性的多個單個細胞器和大分子復(fù)合物的標(biāo)記聯(lián)系在一起。此后不久，stanislav von provazek開始了一個新的時代，他使用熒光顯微鏡研究固定組織和活細胞中的染料結(jié)合。然而，直到20世紀40年代初期，albert coons開發(fā)了一種用熒光染料標(biāo)記抗體的技術(shù)，因此誕生了免疫熒光領(lǐng)域。到二十一世紀之交，熒光顯微鏡領(lǐng)域正在引起細胞生物學(xué)革命，將活細胞成像的能力與合成和基因編碼的熒光探針的高度特異性的多個單個細胞器和大分子復(fù)合物的標(biāo)記聯(lián)系在一起。此后不久，stanislav von provazek開始了一個新的時代，他用熒光顯微鏡研究固定組織和活細胞中的染料結(jié)合。然而，直到20世紀40年代初期，albert coons開發(fā)了一種用熒光染料標(biāo)記抗體的技術(shù)，因此誕生了免疫熒光領(lǐng)域。到二十一世紀之交，熒光顯微鏡領(lǐng)域正在引起細胞生物學(xué)革命，將活細胞成像的能力與合成和基因編碼的熒光探針的高度特異性的多個單個細胞器和大分子復(fù)合物的標(biāo)記聯(lián)系在一起。直到20世紀40年代初，albert coons開發(fā)了一種用熒光染料標(biāo)記抗體的技術(shù)，由此誕生了免疫熒光領(lǐng)域。到二十一世紀之交，熒光顯微鏡領(lǐng)域正在引起細胞生物學(xué)革命，將活細胞成像的能力與合成和基因編碼的熒光探針的高度特異性的多個單個細胞器和大分子復(fù)合物的標(biāo)記聯(lián)系在一起。直到20世紀40年代初，albert coons開發(fā)了一種用熒光染料標(biāo)記抗體的技術(shù)，由此誕生了免疫熒光領(lǐng)域。到二十一世紀之交，熒光顯微鏡領(lǐng)域正在引起細胞生物學(xué)革命，將活細胞成像的能力與合成和基因編碼的熒光探針的高度特異性的多個單個細胞器和大分子復(fù)合物的標(biāo)記聯(lián)系在一起。
熒光過程的時間范圍
過渡期處理速率常數(shù)時間刻度（秒）
s(0) => s(1) or s(n) 吸收（激發(fā)） 瞬間 10-15
s(n) => s(1) 內(nèi)部轉(zhuǎn)換 k(ic) 10-14 to 10-10
s(1) => s(1) 振動松弛 k(vr) 10-12 to 10-10
s(1) => s(0) 熒光 k(f) or γ 10-9 to 10-7
s(1) => t(1) 系統(tǒng)間交叉 k(pt) 10-10 to 10-8
s(1) => s(0) 非輻射，松弛淬火 k(nr), k(q) 10-7 to 10-5
t(1) => s(0) 磷光 k(p) 10-3 to 100
t(1) => s(0) 非輻射，松弛淬火 k(nr), k(qt) 10-3 to 100
表格1
通常用高度共軛的多環(huán)芳香族分子來研究熒光，所述多環(huán)芳香族分子存在于基態(tài)的幾個能級中的任何一個能級上，每個能級與電子分子軌道的特定排列相關(guān)聯(lián)。分子的電子狀態(tài)決定了負電荷的分布和整個分子的幾何形狀。對于任何特定的分子，存在幾種不同的電子狀態(tài)（如s（0），s（1）和s（2）所示）在圖1中），取決于總電子能量和各種電子自旋態(tài)的對稱性。每個電子狀態(tài)被進一步細分成與原子核和鍵軌道相關(guān)的許多振動和旋轉(zhuǎn)能級。大多數(shù)有機分子的基態(tài)是一個電子單態(tài)，其中所有電子都是自旋配對的（具有相反的自旋）。在室溫下，只有很少的分子有足夠的內(nèi)能存在于基態(tài)低振動能級以外的任何狀態(tài)，因此激發(fā)過程通常來源于這個能級。
能夠經(jīng)歷電子躍遷的分子類別終導(dǎo)致熒光被稱為熒光探針，熒光染料或簡單的染料。通過吸附或共價鍵與較大的大分子（如核酸，脂質(zhì)，酶或蛋白質(zhì)）結(jié)合的熒光染料稱為熒光團。一般來說，熒光團分為兩大類，稱為內(nèi)在和外在。內(nèi)在的熒光基團，如芳香族氨基酸，神經(jīng)遞質(zhì)，卟啉和綠色熒光蛋白，是天然存在的。外在熒光團是合成染料或改性生物化學(xué)物質(zhì)，加入到樣品中以產(chǎn)生具有特定光譜特性的熒光。
吸收，激發(fā)和發(fā)射
熒光染料對能量的吸收發(fā)生在不同分子軌道中激發(fā)態(tài)的緊密間隔振動和旋轉(zhuǎn)能級之間。熒光團吸收和發(fā)射光所涉及的各種能級典型地由jablonski能量圖（參見圖1）表示，以波蘭物理學(xué)家alexander jablonski教授的名字命名。一個典型的jablonski圖說明了單重態(tài)（s（0））狀態(tài)，以及個（s（1））和第二個（s（2））激發(fā)單線態(tài)作為一堆水平線。在圖1中，較粗的線表示電子能級，而較細的線表示各種振動能態(tài)（旋轉(zhuǎn)能態(tài)被忽略）。取決于過渡是與光子的吸收還是發(fā)射（直線箭頭）相關(guān)聯(lián)，還是由分子內(nèi)部轉(zhuǎn)換或非輻射松弛過程（波形箭頭）導(dǎo)致，狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換被表示為直線或波浪箭頭。垂直向上的箭頭被用來表示激發(fā)過程的瞬時性質(zhì)，而波浪箭頭被保留用于發(fā)生在更長時間尺度上的那些事件。
光的吸收非?？斓兀ù蠹s飛秒，光子行進單個波長所必需的時間）以稱為量子的離散量發(fā)生并且對應(yīng)于熒光團從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的激發(fā)。同樣，通過熒光或磷光的光子的發(fā)射也按照量子來測量。量子（普朗克定律）中的能量由下式表示：
e =hν= hc /λ
其中e是能量，h是普朗克常數(shù)，ν和λ是入射光子的頻率和波長，c是光速。普朗克定律指出吸收光子的輻射能量與頻率成正比，與波長成反比，這意味著較短的入射波長具有更大的能量。由于光波的振蕩電場矢量與分子中的電荷（電子）的相互作用而發(fā)生的熒光團對能量的光子的吸收是全部或者不全的現(xiàn)象，并且只能在入射光稱為吸收帶的特定波長。如果被吸收的光子含有比簡單的電子躍遷所需的能量更多的能量，則多余的能量通常被轉(zhuǎn)換成振動能量和旋轉(zhuǎn)能量。然而，如果分子和能量不足以促進轉(zhuǎn)變的光子之間發(fā)生碰撞，則不會發(fā)生吸收。光譜寬的吸收帶由緊密間隔的振動能級加上熱運動引起，使得一定范圍的光子能量匹配特定的躍遷。因為通過吸收激發(fā)分子通常在電子自旋配對中沒有改變，所以激發(fā)態(tài)也是單態(tài)。通常，熒光研究是利用具有范圍從電磁光譜（250至700納米）的紫外至可見光區(qū)域的波長的輻射進行的。
對于紫外或可見光，常見的熒光團通常被激發(fā)至（s（1））或第二（s（2））單態(tài)能態(tài)的較高振動水平。圖1中呈現(xiàn)的吸收（或激發(fā)）躍遷之一（左手綠色箭頭）從基態(tài)的低振動能級到第二激發(fā)態(tài)（表示為s（0）的躍遷） = 0到s（2） = 3）。從基態(tài)的第二振動能級到激發(fā)態(tài)的振動能級（表示為s（0） = 1到s（1））描繪了第二激發(fā)躍遷，= 5）。在典型的熒光團中，具有廣譜波長的輻照將產(chǎn)生整個范圍的允許躍遷，這些躍遷占據(jù)激發(fā)態(tài)的各種振動能級。這些轉(zhuǎn)變中的一些將比其他轉(zhuǎn)變的概率高得多，并且當(dāng)它們結(jié)合時將構(gòu)成分子的吸收光譜。請注意，對于大多數(shù)熒光團，吸收和激發(fā)光譜是不同的，但往往重疊，有時可能無法區(qū)分。在其他情況下（例如熒光素），吸收和激發(fā)光譜明顯分開。
在光子被吸收之后，幾種過程將以不同的概率發(fā)生，但可能是激發(fā)態(tài)的低振動能級（s（1） = 0;圖1）的弛豫。這個過程被稱為內(nèi)部轉(zhuǎn)換或振動松弛（在沒有光發(fā)射的情況下的能量損失），并且通常發(fā)生在皮秒或更小。由于大量的振動周期在激發(fā)態(tài)的壽命期間發(fā)生，所以分子在激發(fā)的壽命期間實際上總是經(jīng)歷*的振動松弛。多余的振動能量轉(zhuǎn)化為熱量，在與激發(fā)態(tài)熒光團碰撞時被相鄰的溶劑分子吸收。
激發(fā)的分子在后激發(fā)的單線態(tài)（s（1））存在幾納秒量級（熒光過程中長的時間周期幾個數(shù)量級），然后終放松到基態(tài)。如果從這個長壽命狀態(tài)的放松伴隨著光子的發(fā)射，這個過程在形式上被稱為熒光?；鶓B(tài)的緊密間隔的振動能級在與正常熱運動結(jié)合時，在發(fā)射期間產(chǎn)生寬范圍的光子能量。結(jié)果，熒光通常被看作是波長帶上的發(fā)射強度而不是尖銳的線。在高反應(yīng)性激發(fā)態(tài)分子之前，大多數(shù)熒光團可以重復(fù)激發(fā)和發(fā)射循環(huán)數(shù)百到數(shù)千次光漂白，導(dǎo)致熒光的破壞。例如，經(jīng)過深入研究的探針異硫氰酸熒光素（fitc）可以在分子不再響應(yīng)入射照明之前進行大約30,000次循環(huán)的激發(fā)和弛豫。
幾個其他有不同程度的放松途徑與熒光發(fā)射過程競爭。激發(fā)態(tài)能量可以作為熱量非輻射散射（如圖1中的青色波浪箭頭所示），激發(fā)的熒光團可以與另一個分子碰撞以在第二種類型的非輻射過程（例如淬火，如圖1中紫色波浪箭頭所示），或者出現(xiàn)一個稱為系間竄到低激發(fā)三重態(tài)的現(xiàn)象（圖1中的藍色波浪箭頭）。后者事件相對較少，但終導(dǎo)致通過磷光發(fā)射光子或轉(zhuǎn)變回激發(fā)的單態(tài)，從而產(chǎn)生延遲的熒光。禁止從三重激發(fā)態(tài)到單重基態(tài)的轉(zhuǎn)變，這導(dǎo)致三重態(tài)發(fā)射的速率常數(shù)比熒光的低幾個數(shù)量級。
兩個三重態(tài)轉(zhuǎn)變都在圖1所示的jablonski能量分布圖的右側(cè)示出。系統(tǒng)間交叉的低概率來自分子必須首*行自旋轉(zhuǎn)變產(chǎn)生不成對的電子，這是一個不利的過程。三重態(tài)的主要重要性是分子在這種狀態(tài)下表現(xiàn)出的高度化學(xué)反應(yīng)性，這常常導(dǎo)致光漂白和產(chǎn)生有害的自由基。在生物樣品中，溶解氧是三重態(tài)熒光團非常有效的猝滅劑。通常是三重態(tài)的基態(tài)氧分子可以被激發(fā)成反應(yīng)性單態(tài)，導(dǎo)致漂白熒光團或?qū)罴毎@示光毒性作用的反應(yīng)。三重態(tài)的熒光團也可以直接與其他生物分子反應(yīng)，常常導(dǎo)致兩種物質(zhì)的失活。含有重原子的分子，如鹵素和許多過渡金屬，
從基態(tài)（s（0））到激發(fā)單重態(tài)（s（1））發(fā)生躍遷的概率取決于電子駐留在基態(tài)時的振動和旋轉(zhuǎn)能態(tài)之間的相似程度，如圖2所示。圖2所示的弗蘭克 - 康登（franck-condon）能量圖給出了地面（s（0））和激發(fā)（s（1））各級的振動能量概率分布。）陳述了一個假想的分子。在如此短的時間范圍內(nèi)（飛秒），從地面到激發(fā)態(tài)的激發(fā)躍遷（紅線）發(fā)生，與鍵軌道相關(guān)的核間距離沒有足夠的時間變化，因此過渡表現(xiàn)為垂直線。這個概念被稱為弗蘭克 - 康登原則。大吸收的波長（中心的紅線）代表基態(tài)中可能的核內(nèi)分離到激發(fā)態(tài)允許的振動能級。
在室溫下，熱能不足以顯著占據(jù)激發(fā)態(tài)能量，電子可能的狀態(tài)是基態(tài)（s（o）），其中包含許多不同的振動能量狀態(tài)，每個具有不同的能級。的轉(zhuǎn)換將是轉(zhuǎn)動和振動電子密度概率在基態(tài)和激發(fā)態(tài)中大重疊的轉(zhuǎn)換（見圖2）。然而，不同波長（和量子）的入射光子可能有足夠的能量被吸收，并經(jīng)常產(chǎn)生從其它核內(nèi)分離距離和振動能級的轉(zhuǎn)變。這種效應(yīng)產(chǎn)生了包含多個峰的吸收光譜（圖3）。與熒光團中的吸收躍遷相關(guān)的光子能量范圍廣泛導(dǎo)致產(chǎn)生的光譜顯示為寬帶而不是離散線。
圖3所示的假想吸收光譜（藍色帶）是由幾種有利的從基態(tài)到低激發(fā)能態(tài)（分別標(biāo)記為s（0）和s（1））的電子躍遷產(chǎn)生的。疊加在吸收光譜上的是垂直線（黃色），表示從基態(tài)的低振動能級到激發(fā)態(tài)的較高振動能級的躍遷。請注意，躍遷到的激發(fā)振動能級是那些在較高光子能量（較低波長或較高波數(shù)）下出現(xiàn)的振動能級。與電子躍遷有關(guān)的近似能量用電子伏特（ev）表示）沿著圖3的上方橫坐標(biāo)。與地面和激發(fā)狀態(tài)相關(guān)的振動水平也被包括在右手縱坐標(biāo)中。
掃描熒光團的吸收光譜，同時記錄單一波長（通常是大發(fā)射強度的波長）的發(fā)射強度將產(chǎn)生激發(fā)光譜。類似地，在掃描發(fā)射波長的同時激發(fā)單個波長（再次，優(yōu)選大吸收的波長）的熒光團將揭示發(fā)射光譜分布。激發(fā)和發(fā)射光譜可以被認為是概率分布函數(shù)，其中給定量子能量的光子將被吸收并且終使得熒光團能夠以熒光輻射的形式發(fā)射第二光子。
斯托克斯移位和鏡像規(guī)則
如果仔細檢查熒光團的熒光發(fā)射光譜，幾個重要的特征就變得很明顯了。由于從較高的初始激發(fā)態(tài)到s（1）的低振動能級的快速內(nèi)部轉(zhuǎn)換，發(fā)射譜與激發(fā)能（波長）無關(guān)，興奮狀態(tài)。對于許多常見的熒光基團，振動能級間距對于基態(tài)和激發(fā)態(tài)是相似的，這導(dǎo)致熒光光譜非常類似于吸收光譜的鏡像。這是因為相同的轉(zhuǎn)換對于吸收和發(fā)射都是利的。后，在解決方案（通常研究熒光團）中，詳細的振動結(jié)構(gòu)通常會丟失，發(fā)射光譜顯示為寬帶。
如前所述，在光子吸收之后，激發(fā)的熒光團將快速地經(jīng)歷弛豫到激發(fā)態(tài)的低振動能級。這種快速內(nèi)部轉(zhuǎn)換的一個重要結(jié)果是所有后續(xù)的弛豫路徑（熒光，非輻射松弛，系統(tǒng)間交叉等）從激發(fā)態(tài)的低振動水平（s（1））開始。與吸收一樣，處于激發(fā)態(tài)的電子將返回到基態(tài)的特定振動能級的概率與各自狀態(tài)的能級之間的重疊成正比（圖2）。返回轉(zhuǎn)換到基態(tài)（s（0））通常發(fā)生到更高的振動水平（見圖3），隨后達到熱平衡（振動松弛）。因為光子的發(fā)射常常使熒光團離開較高的振動基態(tài)，所以發(fā)射光譜典型地是從地面到激發(fā)態(tài)躍遷產(chǎn)生的吸收光譜的鏡像。實際上，電子返回到基態(tài)的特定振動能級的概率類似于在激發(fā)之前電子在基態(tài)的位置的概率。這個概念，被稱為鏡像規(guī)則在圖3中對從激發(fā)態(tài)的低振動能級到基態(tài)各種振動能級的發(fā)射躍遷（藍線）進行了說明。產(chǎn)生的發(fā)射光譜（紅色波段）是由假設(shè)的發(fā)色團顯示的吸收光譜的鏡像。
在許多情況下，高能量光子的激發(fā)導(dǎo)致更高的電子和振動能級（s（2），s（3）等），當(dāng)熒光團放松到激發(fā)態(tài)的低振動水平（見圖1）時，其迅速失去過多的能量。由于這種快速的弛豫過程，發(fā)射光譜通常獨立于激發(fā)波長（一些熒光團從較高能態(tài)發(fā)射，但這種活性很少）。由于這個原因，發(fā)射是基態(tài)到低激發(fā)態(tài)躍遷的鏡像，而不是整個吸收譜，可能包括躍遷到較高能級。鏡像規(guī)則的一個很好的測試是在波數(shù)（波長的倒數(shù)或每厘米波的數(shù)量）的線性圖中檢查吸收和發(fā)射光譜，其與頻率和量子能量成正比。當(dāng)以這種方式呈現(xiàn)時（見圖3），
圖4顯示了奎寧的吸收和發(fā)射光譜，奎寧是自然產(chǎn)生的抗瘧藥（和個已知的熒光團），其熒光特性初是由約翰·弗雷德里克·威廉·赫歇爾爵士于1845年描述的。奎寧并不遵守鏡像規(guī)則通過檢查發(fā)射光譜（在460納米處）的單峰來證明，其不反映在雙峰吸收光譜中以310和350納米為特征的兩個峰。波長較短的紫外吸收峰（310納米）是由于激發(fā)躍遷到第二激發(fā)態(tài)（從s（0）到s（2）），迅速弛豫到低激發(fā)態(tài)（s（1））。因此，熒光發(fā)射*從低激發(fā)單重態(tài)（s（1））發(fā)生，導(dǎo)致在奎寧反射地面到激發(fā)態(tài)躍遷（350納米峰）的光譜而不是整個吸收光譜。
因為與熒光發(fā)射躍遷相關(guān)的能量（見圖1-4）通常小于吸收的能量，所產(chǎn)生的發(fā)射的光子具有較少的能量并被轉(zhuǎn)移到較長的波長。這種現(xiàn)象通常被稱為斯托克斯位移（stokes shift），并且?guī)缀醢l(fā)生在溶液研究中常用的所有熒光團。斯托克斯頻移的主要來源是激發(fā)電子迅速衰減到s（1）的低振動能級，興奮狀態(tài)。另外，熒光發(fā)射通常伴隨著基態(tài)的較高振動能級的躍遷，導(dǎo)致激發(fā)能量的進一步損失以熱量平衡過量的振動能量。其他事件，例如溶劑取向效應(yīng)，激發(fā)態(tài)反應(yīng)，復(fù)合物形成和共振能量轉(zhuǎn)移也可以有助于較長的發(fā)射波長。
在實踐中，斯托克斯位移被測量為特定熒光染料或熒光團的激發(fā)和發(fā)射光譜中大波長之間的差異。偏移的大小隨分子結(jié)構(gòu)而變化，但范圍可從幾納米到幾百納米。例如，熒光素的斯托克斯位移大約為20納米，而奎寧的位移是110納米（見圖4），卟啉的位移超過200納米。斯托克斯位移的存在對熒光成像測量的*靈敏度至關(guān)重要。
消光系數(shù)，量子產(chǎn)率和熒光壽命
通常用于描述和比較熒光團的三個基本參數(shù)是消光系數(shù)（ε），量子產(chǎn)率（φ）和熒光壽命（τ）。摩爾消光系數(shù)在光譜，顯微鏡和熒光領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，以將吸光度單位轉(zhuǎn)換為各種化學(xué)物質(zhì)的摩爾濃度單位。消光系數(shù)通過測量一個摩爾（m）的參考波長（吸收分子的特征）的吸光度來確定）濃度（1摩爾/升）的目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)在具有1厘米路徑長度的比色杯中。參考波長通常是紫外或可見光譜中大吸收的波長。消光系數(shù)是熒光團吸收光的能力的直接量度，具有高消光系數(shù)的發(fā)色團也具有高的熒光發(fā)射概率。而且，因為熒光團的固有壽命（下面討論）與消光系數(shù)成反比，所以表現(xiàn)出高消光系數(shù)的分子具有固有壽命短的激發(fā)態(tài)。
量子產(chǎn)額（有時被錯誤地稱為量子效率）是測量相對于所有可能的弛豫途徑的熒光發(fā)射效率的標(biāo)準，通常表示為發(fā)射的光子與吸收的光子數(shù)量的（無量綱）比率。換句話說，量子產(chǎn)額表示給定的激發(fā)熒光染料將產(chǎn)生發(fā)射的光子（熒光）的概率。量子產(chǎn)率通常介于0和1之間，熒光分子通常在顯微鏡中用作探針，量子產(chǎn)率范圍從非常低（0.05或更?。┑綆缀跻恢拢恋臒晒鈭F）。一般來說，在大多數(shù)成像應(yīng)用中，高量子產(chǎn)率是合乎需要的。給定熒光團的量子產(chǎn)率隨著諸如ph，濃度和溶劑極性的環(huán)境因素而變化，有時甚至變成極大的。
熒光壽命是分子在返回到基態(tài)之前保持激發(fā)狀態(tài)的特征時間，并且是從發(fā)射分布中獲取信息的可用時間的指標(biāo)。在激發(fā)態(tài)壽命期間，熒光團可以發(fā)生構(gòu)象變化以及與其他分子相互作用并在局部環(huán)境中擴散。熒光強度隨著時間的變化在用短暫的光脈沖激發(fā)的均勻分子群體中的衰減由指數(shù)函數(shù)描述：
i(t) = io • e(-t/τ)
其中i（t）是在時間t測量的熒光強度，i（o）是激發(fā)后立即觀察到的初始強度，τ是熒光壽命。形式上，熒光壽命被定義為熒光團的初始熒光強度衰減到初始強度的1 / e（約37％）的時間（見圖5（a））。這個量是從激發(fā)態(tài)到基態(tài)熒光衰減的速率常數(shù)的倒數(shù)。
因為熒光水平與激發(fā)單態(tài)中的分子數(shù)量成正比，所以壽命測量可以通過在短暫的激發(fā)脈沖之后測量熒光衰減來進行。在均勻溶劑中，熒光衰減通常是單指數(shù)函數(shù)，如圖5（a）和5（b）中熒光強度隨時間變化的曲線所示。更復(fù)雜的系統(tǒng)，如活組織和活細胞，包含一組混合的環(huán)境，當(dāng)測量熒光衰減時，通常會產(chǎn)生多指數(shù)值（圖5（c））。另外，其他幾個過程可以與熒光發(fā)射相競爭，使激發(fā)態(tài)電子返回到基態(tài)，包括內(nèi)部轉(zhuǎn)換，磷光（系統(tǒng)間交叉）和淬滅。
競爭激發(fā)態(tài)電子去激活的所有非熒光過程可方便地組合成單一速率常數(shù)，稱為非輻射速率常數(shù)并由變量k（nr）表示。非輻射速率常數(shù)通常忽略振動弛豫的任何貢獻，因為這些轉(zhuǎn)換的快速速度（皮秒）比較慢的去激活（納秒）轉(zhuǎn)換快幾個數(shù)量級。因此，量子產(chǎn)率現(xiàn)在可以用速率常數(shù)來表示：
φ=光子發(fā)射/光子吸收= kf/(kf + knf) = τf/τo
其中k（f）是熒光衰減的速率常數(shù)（符號γ也用于表示該速率常數(shù)）。衰變速率常數(shù)的倒數(shù)等于本征壽命（τ（o）），其定義為在缺乏競爭激發(fā)態(tài)失活的所有過程的情況下激發(fā)態(tài)的壽命。實際上，通過非輻射過程縮短了熒光激發(fā)態(tài)壽命，導(dǎo)致測量壽命（τ（f）），其是本征壽命和競爭性非熒光弛豫機制的組合。由于測量的壽命總是小于固有壽命，所以量子產(chǎn)額永遠不會超過統(tǒng)一值。
光學(xué)顯微鏡中使用的許多常見探針的熒光壽命都是以納秒為單位進行測量的，但是這些可以在很寬的范圍內(nèi)變化，取決于分子結(jié)構(gòu)，溶劑和環(huán)境條件。定量熒光壽命測量使研究人員能夠區(qū)分具有相似光譜特征但壽命不同的熒光團，并且還能夠為當(dāng)?shù)丨h(huán)境提供線索。具體而言，可以在不知道局部熒光團濃度的情況下確定探針附近的離子的ph和濃度，這在與探針濃度可能不均勻的活細胞和組織一起使用時具有顯著的益處。另外，壽命測量對于光漂白偽像不如對亮度測量敏感。
淬火和漂白
淬滅和光漂白的后果是有效地減少發(fā)射量，并且在設(shè)計和執(zhí)行熒光檢查時應(yīng)該是首要的考慮因素。這兩種現(xiàn)象是明顯的，淬火往往是可逆的，而光漂白不是。淬火是由激發(fā)態(tài)電子的非輻射弛豫（沒有光子發(fā)射）到基態(tài)的各種競爭過程引起的，其可以是分子內(nèi)的或分子間的。由于非輻射躍遷途徑與熒光弛豫競爭，它們通常大大降低，或在某些情況下*消除輻射。大多數(shù)淬滅過程起著降低激發(fā)態(tài)壽命和受影響熒光團的量子產(chǎn)率的作用。
激發(fā)態(tài)熒光團與溶液中另一種（非熒光）分子的碰撞觀察到一個常見的淬滅實例，導(dǎo)致熒光團失活并返回到基態(tài)。在大多數(shù)情況下，兩種分子在碰撞淬滅過程中都沒有發(fā)生化學(xué)變化。各種簡單的元素和化合物表現(xiàn)為碰撞猝滅劑，包括氧，鹵素，胺和許多缺電子的有機分子。碰撞猝滅可以揭示局部猝滅劑分子或部分的存在，其通過擴散或構(gòu)象變化可能在激發(fā)態(tài)壽命期間與熒光團發(fā)生碰撞。碰撞猝滅的機制包括電子轉(zhuǎn)移，自旋軌道耦合和系統(tǒng)間躍遷到激發(fā)三重態(tài)。通常與碰撞淬滅交替使用的其他術(shù)語是內(nèi)部轉(zhuǎn)化和動態(tài)淬滅。
稱為靜態(tài)或復(fù)雜的第二種類型的淬火機構(gòu)猝滅是由猝滅劑和熒光團之間形成的非熒光復(fù)合物引起的，其通過減少活性的，可激發(fā)的分子群來限制吸收。當(dāng)熒光物質(zhì)與基態(tài)中的猝滅劑分子形成可逆復(fù)合物，并且不依賴擴散或分子碰撞時，發(fā)生這種效應(yīng)。在靜態(tài)淬滅中，熒光發(fā)射減少而不改變激發(fā)態(tài)壽命。處于激發(fā)態(tài)的熒光團也可以通過雙極共振能量轉(zhuǎn)移機制來猝滅，當(dāng)與受激分子緊密接近時，激發(fā)態(tài)能量可以被非輻射轉(zhuǎn)移。在某些情況下，淬滅可以通過非分子機制發(fā)生，例如吸收物質(zhì)（包括發(fā)色團本身）對入射光的衰減。
與淬火相比，光漂白（也稱為褪色）發(fā)生在熒光團由于光子誘導(dǎo)的化學(xué)損傷和共價修飾而失去發(fā)熒光的能力時發(fā)生。從激發(fā)的單線態(tài)躍遷到激發(fā)的三線態(tài)時，熒光團可能與另一個分子相互作用，產(chǎn)生不可逆的共價修飾。三重態(tài)相對于單重態(tài)而言相對較長，因此允許激發(fā)的分子在更長的時間范圍內(nèi)與環(huán)境中的組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。在光漂白之前特定熒光團發(fā)生的激發(fā)和發(fā)射循環(huán)的平均次數(shù)取決于分子結(jié)構(gòu)和當(dāng)?shù)丨h(huán)境。一些熒光團在僅發(fā)射少量光子后快速漂白，而另一些熒光團在漂白之前可以經(jīng)歷數(shù)千或數(shù)百萬次循環(huán)。
圖6中顯示的是在不同時間點捕獲的一系列數(shù)字圖像中觀察到的牛肺動脈上皮細胞多重染色培養(yǎng)的光漂白（褪色）的典型例子。細胞核用4,6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi）染色; 藍色熒光），而線粒體和肌動蛋白細胞骨架分別用mitotracker red（紅色熒光）和鬼筆環(huán)肽衍生物（綠色熒光）染色。使用熒光濾光片組合，以兩分鐘的時間間隔進行時間點，所述熒光濾光片組合具有調(diào)諧的帶寬以同時激發(fā)三種熒光團，同時還記錄組合的發(fā)射信號。請注意，圖6（a）中所有三種熒光團都具有相對較高的強度，但dapi（藍色）強度在兩分鐘時開始快速下降，六分鐘后幾乎*消失。線粒體和肌動蛋白染色對光漂白更有抵抗力，但在定時序列（10分鐘）期間，兩者的強度均下降。
一類重要的光漂白事件是光動力學(xué)意味著它們涉及熒光團與光和氧的組合的相互作用。熒光團和分子氧之間的反應(yīng)破壞熒光并產(chǎn)生可以化學(xué)修飾活細胞中的其他分子的自由基單線態(tài)氧物質(zhì)。由光動力學(xué)事件引起的光漂白量是分子氧濃度和熒光團，氧分子和其他細胞組分之間的近端距離的函數(shù)。通過限制熒光團照射的時間或降低激發(fā)能量可以減少光漂白。然而，這些技術(shù)也減少了可測量的熒光信號。在許多情況下，熒光團或細胞懸液的溶液可以被脫氧，但這對于活細胞和組織是不可行的。
在某些情況下，光漂白效應(yīng)也可以用來獲得否則不可用的特定信息。例如，在光漂白（frap）實驗之后的熒光恢復(fù)中，目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的熒光團有意地被過度水平的輻射漂白。當(dāng)新的熒光團分子擴散到樣本的漂白區(qū)域（恢復(fù)）時，監(jiān)測熒光發(fā)射強度以確定目標(biāo)熒光團的橫向擴散速率。以這種方式，熒光標(biāo)記分子的平移遷移率可以在單個細胞或活組織切片的非常小的（2至5微米）區(qū)域內(nèi)確定。
溶劑對熒光發(fā)射的影響
多種環(huán)境因素影響熒光發(fā)射，包括熒光團和周圍溶劑分子之間的相互作用（由溶劑極性決定），其他溶解的無機和有機化合物，溫度，ph以及熒光物質(zhì)的局部濃度。這些參數(shù)的影響從一個熒光團到另一個熒光團變化很大，但是吸收和發(fā)射光譜以及量子產(chǎn)率可能受環(huán)境變量的嚴重影響。事實上，熒光的高度敏感性主要是由于激發(fā)態(tài)壽命期間在局部環(huán)境中發(fā)生的相互作用。熒光團可以被認為是在激發(fā)態(tài)（比基態(tài)）*不同的分子，
在溶液中，基態(tài)熒光團周圍的溶劑分子也具有偶極矩，其可以與熒光團的偶極矩相互作用，以在熒光團周圍產(chǎn)生溶劑分子的有序分布。熒光團中的基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間的能級差異引起分子偶極矩的變化，其終誘導(dǎo)周圍溶劑分子的重排。然而，franck-condon原理規(guī)定，在激發(fā)熒光團時，分子在較短的時間范圍內(nèi)被激發(fā)到較高的電子能級，而熒光團和溶劑分子在溶劑 - 溶質(zhì)內(nèi)重新定向互動環(huán)境。結(jié)果是，
在熒光團被激發(fā)到激發(fā)單重態(tài)（s（1））的較高振動水平之后，隨著熒光團緩慢松弛到低振動能級（在皮秒時間內(nèi)發(fā)生），過量的振動能量迅速損失到周圍溶劑分子規(guī)模）。溶劑分子通過重新定向幫助穩(wěn)定并進一步降低激發(fā)態(tài)的能級（稱為溶劑松弛）圍繞激發(fā)的熒光團以較慢的過程需要10到100皮秒。這具有減少地面和激發(fā)態(tài)之間的能量分離的效果，這導(dǎo)致熒光發(fā)射的紅移（對較長的波長）。增加溶劑極性會使激發(fā)態(tài)能級相應(yīng)地降低，而降低溶劑極性則會降低溶劑對激發(fā)態(tài)能級的影響。熒光團的極性也決定了激發(fā)態(tài)對溶劑效應(yīng)的敏感性。極性和帶電荷的熒光團顯示出比非極性熒光團更強的作用。
溶劑對熒光的松弛作用可以對斯托克斯位移的大小產(chǎn)生顯著的影響。例如，氨基酸*的雜環(huán)吲哚部分通常駐留在周圍介質(zhì)的相對極性較低的蛋白質(zhì)的疏水內(nèi)部。用熱或化學(xué)試劑使典型的宿主蛋白質(zhì)變性后，隨著吲哚環(huán)進入周圍的水溶液，*殘基的環(huán)境從非極性變成高極性。由于溶劑效應(yīng)，熒光發(fā)射的波長從約330納米增加到365納米，這是一個35納米的位移。因此，本征和外在熒光探針的發(fā)射光譜可以用來探測溶劑極性效應(yīng)，分子結(jié)合，
定量熒光調(diào)查應(yīng)不斷監(jiān)測，以掃描發(fā)射情況中的潛在變化，即使這些變化無意或無法預(yù)料。在可以建立均勻濃度的簡單系統(tǒng)中，隨著熒光團濃度的增加，應(yīng)當(dāng)觀察到逐漸增加的發(fā)射強度增加，反之亦然。然而，在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中，熒光探針濃度可能在很寬的范圍內(nèi)局部變化，并且強度波動或光譜漂移通常是由于ph，鈣離子濃度，能量轉(zhuǎn)移或猝滅劑而不是熒光團化學(xué)計量。在評估實驗過程的結(jié)果時，應(yīng)始終考慮到意外溶劑或其他環(huán)境影響的可能性。
熒光各向異性
當(dāng)內(nèi)部或外部熒光團被平面偏振光激發(fā)時，來自各種樣品的熒光發(fā)射變得極化。用各向異性來描述極化發(fā)射的水平，并且顯示一定程度各向異性的樣本也顯示可檢測的極化發(fā)射水平。熒光各向異性的觀察和測量基于熒光團的光選擇性激發(fā)，這是由于吸收偶極矩與照射光子（偏振光）的定向電場矢量的瞬態(tài)對準。當(dāng)熒光團吸收入射光子時，激發(fā)事件是由入射輻射的振蕩電場分量和由熒光分子軌道的電子狀態(tài)產(chǎn)生的躍遷偶極矩之間的相互作用引起的。熒光團優(yōu)先吸收具有平行于熒光團的吸收躍遷偶極矩排列的電場矢量的那些光子。
熒光發(fā)射也發(fā)生在由發(fā)射躍遷偶極矩定義的平面內(nèi)。每個熒光團在其分子框架內(nèi)固定了吸收和發(fā)射躍遷偶極矩（圖8），它們具有相對于染料分子的分子軸定義的取向并且彼此分開一個角度（θ）。圖8中顯示了假設(shè)的三核芳香族雜環(huán)熒光團（排列類似于吖啶環(huán)系統(tǒng)），其上覆蓋有表示吸收（黃色箭頭）和發(fā)射（紅色箭頭）躍遷偶極矩矢量的空間關(guān)系的箭頭。在激發(fā)態(tài)壽命（τ）時，熒光團的旋轉(zhuǎn)將使其發(fā)射相對于激發(fā)矢量去極化，從而導(dǎo)致用于測量含有熒光團的環(huán)境的剛性的機制。
含有具有平面偏振光的隨機定向熒光團的各向同性溶液的照射將優(yōu)先僅激發(fā)其吸收躍遷偶極矩與偏振電矢量平面平行（或幾乎如此）排列的那些分子。吸收的可能性實際上與偶極子和入射光的電場矢量之間的角度的余弦平方成正比（當(dāng)角度為零度時，吸收是大的并且在角度接近90度時達到小值）。結(jié)果將是來自原始合奏的激發(fā)熒光團亞群的特定光選擇過程，產(chǎn)生平行于特定軸取向的激發(fā)態(tài)熒光團。這個亞群的熒光發(fā)射也將部分極化。p）或各向異性（r），如等式所示：
p = (i|| - i⊥)/(i|| + i⊥) and r = (i|| - i⊥)/(i|| + 2i⊥)
其中i（||）是在平行于激發(fā)平面的平面內(nèi)測得的熒光發(fā)射，i（⊥）是在垂直于激發(fā)平面的平面內(nèi)測得的熒光發(fā)射。實際上，通過測量放置在激發(fā)光路中的偏振器收集的發(fā)射和放置在與激發(fā)偏振器平行或垂直的發(fā)射光路中的分析器來計算偏振光量（參見圖9）。各向異性和極化都是相同現(xiàn)象的表達式，并且這些值可以容易地相互轉(zhuǎn)換。在大多數(shù)情況下，各向異性表達式是優(yōu)選的，因為當(dāng)以該參數(shù)表示時，相關(guān)聯(lián)的數(shù)學(xué)方程式更簡單。
由于發(fā)射躍遷偶極矩由于空間取向而從激發(fā)躍遷時刻偏移（見圖8），即使熒光團固定在適當(dāng)位置，也會發(fā)生一定程度的去極化。因此，吸收過程本身是熒光去極化的來源。在激發(fā)態(tài)的壽命期間總是發(fā)生的熒光團的旋轉(zhuǎn)運動導(dǎo)致發(fā)射躍遷偶極子從原始取向上的額外位移，并且將進一步降低觀察到的發(fā)射各向異性。旋轉(zhuǎn)速率取決于熒光團（或與之結(jié)合的大分子）的大小以及其局部環(huán)境的粘度。
r0/r = 1 + (rtτ)/(ηv)
其中r（0）是極限各向異性（在沒有任何熒光團旋轉(zhuǎn)的情況下觀察到的各向異性），r是測量的各向異性，η是環(huán)境粘度，v是旋轉(zhuǎn)分子的體積，r是通用氣體常數(shù)，t是開爾文刻度上溶液的溫度，τ是熒光團激發(fā)態(tài)的壽命。在實踐中，perrin等式被減少以表示在熒光團的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間（φ）方面各向異性的時間依賴性衰減：
r0/r = 1 + τ/φ 其中φ = (ηv)/(rt)
在導(dǎo)致（較低）測量的熒光各向異性值偏離大理論極限的現(xiàn)象中，是在激發(fā)態(tài)壽命期間發(fā)生的分子的自然旋轉(zhuǎn)擴散。在解決方案中，小分子熒光團（高達數(shù)千道爾頓）的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間范圍在50到100皮秒之間，顯著快于發(fā)射速率并且排出或隨機分布發(fā)射躍遷偶極矩。由于典型熒光團的平均激發(fā)態(tài)壽命在納秒級范圍內(nèi)，分子在發(fā)射前能夠旋轉(zhuǎn)多次。結(jié)果，偏振發(fā)射是隨機的，使得凈各向異性為零。
熒光團與更大的大分子的締合導(dǎo)致旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間的顯著增加。在大多數(shù)情況下，溶液中大蛋白質(zhì)的相關(guān)時間在10到50納秒之間，等于或超過典型熒光團的平均激發(fā)態(tài)壽命。熒光團的結(jié)合減慢了熒光探針的旋轉(zhuǎn)運動，并且能夠研究宿主蛋白質(zhì)的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間。較小的蛋白質(zhì)通常比較大的蛋白質(zhì)或參與復(fù)雜生物組裝的蛋白質(zhì)顯示出更短的相關(guān)時間，并且可以預(yù)期產(chǎn)生較低的各向異性。
用光學(xué)顯微鏡測量熒光偏振的儀器方法如圖9所示。平面偏振激發(fā)光是通過使來自電弧放電照明器的光通過線偏振器而產(chǎn)生的。平面偏振的激發(fā)光被吸收偶極矩平行于激發(fā)光平面取向的樣品（在顯微鏡載片上）中的熒光團地吸收。這導(dǎo)致熒光團的特定亞群被激發(fā)（熒光團的各向異性收集）。理論上，所有激發(fā)的熒光團都具有相同的吸收和發(fā)射偶極矩的方向。隨后相對于激發(fā)照射的偏振平面在平行和垂直方向上測量由熒光團發(fā)射的熒光。當(dāng)熒光團在其激發(fā)態(tài)壽命期間旋轉(zhuǎn)時，平行于激發(fā)平面觀察到的發(fā)射水平將不斷降低，而垂直于激發(fā)平面記錄的發(fā)射量將同時增加。
如上所述，熒光各向異性測量可以提供關(guān)于蛋白質(zhì)的旋轉(zhuǎn)遷移率的信息，從中可以推斷出它們的分子量和形狀。另外，可以監(jiān)測分子間締合，以及構(gòu)象變化和蛋白質(zhì)變性。該技術(shù)也被用于檢測蛋白質(zhì)的內(nèi)在靈活性和生物膜的一些物理性質(zhì)，包括粘度，相變，化學(xué)組成和膜擾動對這些性質(zhì)的影響。可以在使用連續(xù)照明的穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)上進行熒光各向異性測量，或者在利用脈沖激發(fā)事件的時間分辨實驗中進行熒光各向異性測量。
共振能量轉(zhuǎn)移
如上所述，處于激發(fā)態(tài)的熒光團可以通過將其轉(zhuǎn)化成光（熒光），通過熱平衡（振動松弛）或通過碰撞或復(fù)合物形成轉(zhuǎn)移到另一個分子而失去激發(fā)能量（非輻射耗散和淬滅）。在形成絡(luò)合物或與溶劑分子碰撞時，能量通過熒光團和第二分子之間的電子軌道的偶聯(lián)來轉(zhuǎn)移。還有另一個過程，稱為共振能量轉(zhuǎn)移（ret），通過這個過程，處于激發(fā)態(tài)的熒光團（稱為供體）可以將其激發(fā)能轉(zhuǎn)移到相鄰的發(fā)色團（受體）通過長距離的偶極 - 偶極子相互作用以非納米的距離測量。共振能量轉(zhuǎn)移的基本理論假設(shè)供體熒光團可以被視為振蕩偶極子，其可以以類似于耦合振蕩器的行為的方式，以特定共振頻率將能量傳遞到類似的偶極子，例如一對調(diào)諧叉振動在相同的頻率。
無論何時供體熒光團的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜重疊，共振能量轉(zhuǎn)移都是可能的，其本身不一定是熒光的。理解這種能量轉(zhuǎn)移機制的一個重要概念是，該過程不涉及來自供體的光的發(fā)射，隨后受體發(fā)射的光子的吸收。換句話說，共振能量轉(zhuǎn)移機制中不存在中間光子。能量轉(zhuǎn)移通過受體存在下供體熒光發(fā)射的猝滅和受體熒光的增加（敏化）發(fā)射來表現(xiàn)。
圖10中顯示了來自耦合的供體和受體分子進行共振能量轉(zhuǎn)移的光譜分布的發(fā)射強度的變化。供體發(fā)射（中心灰色曲線）和受體吸收光譜（中心黃色曲線）之間的重疊（灰色區(qū)域）是發(fā)生該過程所必需的。當(dāng)這種重疊存在時，供體和受體之間的距離小于10納米時，可以將供體激發(fā)能量非輻射地轉(zhuǎn)移給受體。終的結(jié)果是猝滅供體熒光發(fā)射（紅色曲線）和受體發(fā)射強度（致敏發(fā)射，紅色虛線）增加。圖10中的供體和受體的各個光譜分布可以使用圖的左上角的圖例來識別。
共振能量轉(zhuǎn)移的效率隨著光譜重疊程度而變化，但重要的是作為距離的六次方的倒數(shù)（半徑r）分離供體和受體發(fā)色團。將能量轉(zhuǎn)移給受體需要發(fā)色團之間的距離相對接近，在1至10納米的限制范圍內(nèi)。該現(xiàn)象可以通過激發(fā)具有對應(yīng)于供體的吸收（激發(fā)）大值的照射波長的標(biāo)記樣本并檢測受體的峰值發(fā)射波長區(qū)域中的熒光發(fā)射來檢測?；蛘?，可以在存在和不存在受體的情況下測量供體的熒光壽命。能量轉(zhuǎn)移效率對供體和受體間分離距離的依賴性為細胞生物學(xué)研究中共振能量轉(zhuǎn)移的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。共振能量傳遞的這個方面使得該技術(shù)能夠被用作一種光譜統(tǒng)治者研究和量化細胞成分之間的相互作用，以及個別大分子內(nèi)的構(gòu)象變化，在分子水平。
為了發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移，必須建立一組特定的條件。供體發(fā)色團必須能夠以合理的量子產(chǎn)率與足夠長的壽命耦合，并且供體和受體分子之間的距離必須相對較短（在大多數(shù)情況下僅為幾納米）。另外，如上所述，共振能量轉(zhuǎn)移研究的設(shè)計不涉及受體對光的實際重吸收。能量轉(zhuǎn)移率（k（t））和能量轉(zhuǎn)移效率（e（t））都與受體存在或不存在時供體的壽命有關(guān)。能量轉(zhuǎn)移速率常數(shù)表示為：
kt = (1/τd) • (r0/r)6
其中r（0）是臨界福斯特距離，這是供體 - 受體分離半徑，其中能量轉(zhuǎn)移的概率等于沒有受體時的供體去激發(fā)（衰變）率。因此，對于大多數(shù)共振能量轉(zhuǎn)移測量，förster距離通常介于2和7納米之間，是能量轉(zhuǎn)移效率為50％的發(fā)色團之間的距離。同樣在該等式中，τ（d）是用于表示在不存在受體的情況下供體的壽命的變量，并且r是分離供體和受體分子的距離。通過研究該方程，可以清楚地看出，當(dāng)發(fā)色團之間的半徑等于förster距離時，在沒有受體的情況下共振能量轉(zhuǎn)移速率等于供體衰變速率（壽命的倒數(shù)）。此時，轉(zhuǎn)移效率為50％，在受體不存在的情況下，供體發(fā)射將降至正常強度的一半。因為能量轉(zhuǎn)移的速率與分離距離的六次方成反比，供體和受體之間的接近顯然是占主導(dǎo)地位的術(shù)語。用納米表示的臨界福斯特距離按下式計算：
r0 = 2.11 × 10-2 • [η-4q0κ2j(λ)]1/6
福斯特距離方程介紹的概念κ 2（κ平方），這是一個取向因子描述在三維空間中的供體和受體的吸收和發(fā)射偶極之間的空間關(guān)系。如果在兩個發(fā)色團之間的偶極取向是隨機的（由于供體和受體分子的快速旋轉(zhuǎn)），取向因子被認為等于大多數(shù)r（0）計算的統(tǒng)計平均值（2/3或0.67的值）。發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的介質(zhì)的折射率由變量η表示，q（0）是不存在受體時的施主的量子收率。重疊積分，j（λ）定義了供體發(fā)射光譜和受體吸收光譜之間的重疊面積（如圖10中的灰色陰影部分所示）。能量轉(zhuǎn)移效率（e（t））與分離供體和受體（r）的距離有關(guān)：
r = r0[(1/et) - 1]1/6 其中et = 1 - (τda/τd)
因此，通過在受體（τ（da））和不存在受體（τ（d））的情況下測量供體的熒光壽命，），可以確定分離兩種發(fā)色團的能量轉(zhuǎn)移效率和距離。由于共振能量轉(zhuǎn)移的效率在施主壽命期間受到施主和受主的擴散的很大影響，所以時間分辨測量于空間波動系統(tǒng)的分析。轉(zhuǎn)移效率也可以通過使用供體在存在和不存在受體的情況下的相對熒光發(fā)射強度的穩(wěn)態(tài)技術(shù)來測量。然而，這些計算僅限于供體和受體分開固定距離的情況，例如當(dāng)兩個發(fā)色團都結(jié)合到相同的大分子上時。對于不同的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合的供體和受體來說情況并非如此，時間分辨信息往往是必需的。
共振能量轉(zhuǎn)移研究提供*的信息時，從熒光各向異性，溶劑松弛，猝滅，或大多數(shù)激發(fā)態(tài)反應(yīng)的替代實驗相比。大多數(shù)定量熒光測量依賴于熒光團與緊鄰的其他分子（包括周圍溶劑分子）之間的短程相互作用。相反，溶劑效應(yīng)，甚至是大分子（如蛋白質(zhì)或核酸）的存在對供體和受體之間能量轉(zhuǎn)移的效率幾乎沒有影響。與其他技術(shù)不同，測量共振能量轉(zhuǎn)移時考慮的主要因素是供體和受體分子之間的實際物理距離。
結(jié)論
盡管熒光現(xiàn)象看起來幾乎是瞬時的，但就目前的儀器而言，光子吸收和熒光發(fā)射第二個光子之間的相對較長的時間間隔為使用這種顯著方法的大量研究打開了大門。熒光技術(shù)的調(diào)色板包括可觀察到的吸收和發(fā)射光譜，量子產(chǎn)率，壽命，淬滅，光漂白，各向異性，能量轉(zhuǎn)移，溶劑效應(yīng)，擴散，復(fù)合物形成以及許多環(huán)境變量的變化。所有這些因素都可以通過對內(nèi)在和外在熒光團光譜特性的穩(wěn)態(tài)或時間分辨解釋來評估。
當(dāng)與光學(xué)顯微鏡耦合時，熒光使研究人員能夠研究細胞生物學(xué)中廣泛的現(xiàn)象。重要的是分析亞細胞集合體中特定大分子的細胞內(nèi)分布，如核，膜，細胞骨架絲，線粒體，高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。除了對細胞解剖的穩(wěn)態(tài)觀察之外，熒光還可用于探測細胞內(nèi)動力學(xué)以及各種大分子之間的相互作用，包括擴散，結(jié)合常數(shù)，酶促反應(yīng)速率以及各種反應(yīng)機制。其他重要的過程也是使用熒光顯微鏡可用的高度特異性和空間分辨率進行研究的目標(biāo)。例如，熒光探針已用于監(jiān)測細胞內(nèi)ph值和重要離子的局部濃度，并用于研究細胞活力和影響細胞凋亡率的因素。同樣，重要的細胞功能，如內(nèi)吞作用，胞吐作用，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和跨膜電位的產(chǎn)生已經(jīng)在熒光顯微鏡下進行研究。在回顧從熒光分析中受益的大量應(yīng)用時，顯而易見的是，為什么熒光顯微鏡的顯著效用將這一技術(shù)推向了生物醫(yī)學(xué)研究的前沿。用熒光顯微鏡研究了胞吞，胞吐，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，跨膜電位等重要的細胞功能。在回顧從熒光分析中受益的大量應(yīng)用時，顯而易見的是，為什么熒光顯微鏡的顯著效用將這一技術(shù)推向了生物醫(yī)學(xué)研究的前沿。用熒光顯微鏡研究了細胞內(nèi)吞，胞吐，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，跨膜電位等重要的細胞功能。在回顧從熒光分析中受益的大量應(yīng)用時，顯而易見的是，為什么熒光顯微鏡的顯著效用將這一技術(shù)推向了生物醫(yī)學(xué)研究的前沿。