提取培養(yǎng)細胞
一, (動物實驗室)先用酒精沖洗灌流系統(tǒng),然后用蒸餾水再次沖洗(流速可稍快)
二,(細胞實驗室)制作凝膠培養(yǎng)皿(為了有助于細胞貼壁),0.1%gelation 移液器 2ml/皿,輕輕搖晃,讓relation充分鋪在培養(yǎng)皿底部,然后放入37℃,5%co2的恒溫箱中1小時.
1.細胞操作臺是無菌區(qū)域,操作前要用酒精洗手,需要放入操作臺里的藥劑也要用酒精消毒,尤其是瓶口.
2.添加gelation順序為移液器吸取2mlgelation→打開培養(yǎng)皿蓋子→注入gelation→蓋上蓋子→輕搖
三,制作肝臟沖洗液和肝細胞分離液
抽取solutionⅰ40ml加入刻度試管中(兩個 40ml/試管)
抽取solutionⅱ30ml加入刻度試管中(兩個 30ml/試管);抽取solutionⅱ70ml加入刻度試管中(兩個 70ml/試管)
將solutionⅱ30ml的兩個試管加入恒溫箱中預熱
分別稱量12mg和5.4mg各兩份collagenase ,稱量蛋白酶12mg(使用敏感度高的測量器)
四,取小鼠,麻醉0.3ml試劑/只,觀察小鼠呼吸轉(zhuǎn)為淺快說明麻醉成功.剪取兩條長約250px絲線,置于凈水中備用
將solutionⅰ40ml溶液與灌流器相連,用剪刀剪開小鼠腹部毛皮,然后用手充分撕開毛皮,盡量暴露胸腹部,用剪刀剪開小鼠腹部肌肉,露出肝臟和肝靜脈,將之前備好的細線給小鼠肝靜脈打一個松散的活結(jié)備用,打開灌流器,將流量調(diào)低,用針管穿刺肝靜脈并固定,順手剪開小鼠股動脈(右側(cè)),觀察肝臟有限紅色逐漸變白然后呈淺黃色,且股動脈有液體流出,說明穿刺成功,調(diào)高灌流速度, solutionⅰ40ml溶液灌流結(jié)束后,灌流solutionⅱ70ml+12mgcollagenase溶液.
1.灌注solutionⅱ70ml+12mgcollagenase是為了細胞間質(zhì)的膠原蛋白,讓肝細胞松散,易于提取.灌注速度3-4ml/min
2.灌注solutionⅱ70ml+12mgcollagenase成功后,小鼠肝臟會呈現(xiàn)類似與乳糜狀,用鑷子輕觸即破.
3.隨著灌流液量增加,小鼠麻醉藥也隨之排除體外,此時小鼠會出現(xiàn)蘇醒并抽搐.
五,灌流結(jié)束后,用剪刀摘取小鼠肝臟,放置于培養(yǎng)皿中(solutionⅱ12mgcollagenase),在顯微鏡下去除膽囊和大血管,用鑷子輕輕剝離肝細胞,并用剪刀將未*分離的肝*碎.
5.4mgcollagenase+蛋白酶12mg+dna酶0.06ml加入30ml solutionⅱ溶液中混勻做成勻液,將剝離的肝細胞和組織倒入勻液中,置于37℃恒溫液箱中輕微振蕩消化處理30min.(加入dan酶是因為dna有粘著性，防止細胞聚集粘著)。
六，消化處理后的勻液中加入培養(yǎng)液終止消化反應，20g 5min離心分離（肝細胞較重離心后沉于試管底部，上清液大多是細胞外雜質(zhì)），離心后去除上清液，然后用pbs（ph和滲透壓與細胞大致相同）沖洗1-2次，在培養(yǎng)液中加入雙抗，然后顯微鏡下細胞計數(shù)。
細胞計數(shù)的計數(shù)板上的四個正方形角落有很小的計數(shù)方格，細胞計數(shù)時分別計數(shù)那4個小方格，算出平均值x。細胞數(shù)=x*10/ml，每個培養(yǎng)皿中要加入5*10個細胞+1.5ml細胞培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察細胞懸浮于培養(yǎng)基中，然后放入37℃,5%co2的恒溫箱中培養(yǎng)。
七，lps通常置于有菌的環(huán)境中，因此進行細胞培養(yǎng)前要先過濾。1000微克的lps溶于10mldmem，過濾，然后加入30ml dmem充分混勻。