基因擴(kuò)增技術(shù)（pcr）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction簡稱pcr）又稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性dna序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新。可將極微量的靶dna特異地?cái)U(kuò)增上百萬倍，從而大大提高對(duì)dna分子的分析和檢測能力，能檢測單分子dna或?qū)γ?0萬個(gè)細(xì)胞中僅含1個(gè)靶dna分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及遺傳學(xué)等多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。由于pcr具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)，已在病原微生物學(xué)領(lǐng)域中顯示出巨大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景。
pcr技術(shù)是由cetus公司和加利福尼亞大學(xué)1985年聯(lián)合創(chuàng)造的，主要貢獻(xiàn)者為kary b mulis和henerya、erlich。該方法首先被應(yīng)用于人β-珠蛋白dna的擴(kuò)增及鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病的產(chǎn)前診斷。自85年首ci報(bào)道pcr方法以來，pcr被廣泛應(yīng)用于分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、性傳播性疾病及法醫(yī)判定和考古研究等多領(lǐng)域、并發(fā)揮了越來越大的作用。因而發(fā)明人kary b、mulis獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
為了使pcr技術(shù)在臨床上迅速得以普及，我們對(duì)該技術(shù)的某些程序成功地作了重大改革，使pcr技術(shù)變得簡單、微量化、不易發(fā)生污染，從而使pcr技術(shù)常規(guī)化成為可能。我們的方法迅速在全國各大醫(yī)院得到推廣。
一、pcr的基本原理和基本程序
pcr擴(kuò)增dna的原理是：先將含有所需擴(kuò)增分析序列的靶dna雙鏈經(jīng)熱變性處理解開為兩個(gè)寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對(duì)根據(jù)已知dna序列由人工合成的與所擴(kuò)增的dna兩端鄰近序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴(kuò)增的dna片段，一般需20-30個(gè)堿基對(duì)，過少則難保持與dna單鏈的結(jié)合。引物與互補(bǔ)dna結(jié)合后，以靶dna單鏈為模板，經(jīng)反鏈雜交復(fù)性（退火），在taqdna聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dntp）為原料按5'到3'方向?qū)⒁镅由臁⒆詣?dòng)合成新的dna鏈、使dna重新復(fù)制成雙鏈。然后又開始第二次循環(huán)擴(kuò)增。引物在反應(yīng)中不僅起引導(dǎo)作用，而且起著特異性的限制擴(kuò)增dna片段范圍大小的作用。新合成的dna鏈含有引物的互補(bǔ)序列，并又可作為下一輪聚合反應(yīng)的模板。如此重復(fù)上述dna模板加熱變性雙鏈解開—引物退火復(fù)性—在dna聚合酶作用下的引物延伸的循環(huán)過程，使每次循環(huán)延伸的模板又增加1倍，亦即擴(kuò)增dna產(chǎn)物增加1倍，經(jīng)反復(fù)循環(huán)，使靶dna片段指數(shù)性擴(kuò)增。
pcr的擴(kuò)增倍數(shù)y=（1+e）n,這里y是擴(kuò)增量，n為pcr的循環(huán)次數(shù)。e為pcr循環(huán)擴(kuò)增效率。設(shè)pcr擴(kuò)增效率e為100%、循環(huán)次數(shù)n=25次，靶dna將擴(kuò)增到33554432個(gè)拷貝，即擴(kuò)增3355萬倍：若e為80%、n=20、則擴(kuò)增數(shù)量將下降到1408865拷貝，即擴(kuò)增產(chǎn)物約丟失93%，若e=100%，n=20，則擴(kuò)增數(shù)量減少1048576個(gè)拷貝，擴(kuò)增產(chǎn)物約減少97%。可見pcr循環(huán)擴(kuò)增效率及循環(huán)次數(shù)都對(duì)擴(kuò)增數(shù)量有很大影響。pcr擴(kuò)增屬于酶促反應(yīng)，所以，dna擴(kuò)增過程遵循酶促動(dòng)力學(xué)原理。靶dna片段的擴(kuò)增最初表現(xiàn)為直線上升，隨著靶dna片段的逐漸積累，當(dāng)引物—模板/dna/聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)，酶的促化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)靶dna產(chǎn)物的濃度不再增加，即出現(xiàn)所謂平臺(tái)效應(yīng)。pcr反應(yīng)達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間主要取決于反應(yīng)開始時(shí)樣品中的靶dna的含量和擴(kuò)增效率，起始模板量越多到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間就越短、擴(kuò)增效率越高到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間也越短。另外酶的含量，dntp 濃度，非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增都對(duì)到達(dá)平臺(tái)期時(shí)間有影響。
二、pcr的特點(diǎn)
（一）特異性高：shou次報(bào)導(dǎo)的pcr所用的dna聚合酶是大腸桿菌的dnapolymerasei的klenow大片段，其酶活性在90℃會(huì)變性失活，需每次pcr循環(huán)都要重新加入klenow大片段，同時(shí)引物是在37℃延伸（聚合）易產(chǎn)生模板—引物之間的堿基錯(cuò)配、致特異性較差，1988年saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的taqdna聚合酶，在熱變性處理時(shí)不被滅活，不必在每次循環(huán)擴(kuò)增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續(xù)反應(yīng)，顯著地提高pcr產(chǎn)物的特異性，序列分析證明其擴(kuò)增的dna序列與原模板dna一致。擴(kuò)增過程中，單核苷酸的錯(cuò)誤參入程度很低、其錯(cuò)配率一般只有約萬分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對(duì)的特異寡核苷酸引物。pcr能一次確定病毒的多重感染。如用hpv11和hpv16型病毒引物檢測病婦宮頸刮片細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)部分病人存在hpv11和hpv16兩型的雙重感染。
（二）高度敏感：理論上pcr可以按2n倍數(shù)擴(kuò)增dna十億倍以上，實(shí)際應(yīng)用已證實(shí)可以將極微量的靶dna成百萬倍以上地?cái)U(kuò)增到足夠檢測分析量的dna。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞，或?qū)χT如病人口液等只含一個(gè)感染細(xì)胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細(xì)胞的特異性片段樣品中均可檢測。
（三）快速及無放射性：一般在2小時(shí)內(nèi)約可完成30次以上的循環(huán)擴(kuò)增，加上用電泳分析。只需3-4小時(shí)便可完成，不用分離提純病毒，dna粗制品及總rna均可作為反應(yīng)起始物，可直接用臨床標(biāo)本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發(fā)、細(xì)胞、活體組織等粗制的dna的提取液來擴(kuò)增檢測，省去費(fèi)時(shí)繁雜的提純程序，擴(kuò)增產(chǎn)物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，無放射性易于推廣。
（四）簡便：擴(kuò)增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從rna或染色體dna中或部分dna已降解的樣品中分離目的基因，省去常規(guī)方法中須先進(jìn)行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測。如在pcr引物端事先構(gòu)建一個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)，擴(kuò)增的靶dna可直接克隆到m13，puc19等相應(yīng)酶切位點(diǎn)的載體中。
（五）可擴(kuò)增rna或cdna：先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mrna轉(zhuǎn)變成單鏈cdna，再將得到的單鏈cdna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，即使mrna轉(zhuǎn)錄片段只有100ngcdna中的0.01%，也能經(jīng)pcr擴(kuò)增1ng有242堿基對(duì)長度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長的dna中，難以將整段dna大分子擴(kuò)增和做序列分析。若以mrna作模板，則可將外顯子集中，用pcr一次便完成對(duì)外顯子的擴(kuò)增并進(jìn)行序列分析。