甘磷酸膽堿的理化性質(zhì)與生物學(xué)功能及制備方法！
一、背景及概述
甘油磷酸膽堿( gpc)，是人體內(nèi)正常存在的水溶性小分子物質(zhì)，是重要的神經(jīng)傳遞介質(zhì)乙酰膽堿( acetylcholine) 的生物合成前體。gpc 最重要的作用在于其產(chǎn)生的膽堿為水溶性族，對(duì)大腦和神經(jīng)系統(tǒng)具有重要作用，研究顯示gpc 對(duì)某些激素和神經(jīng)傳遞介質(zhì)如乙酰膽堿和人生長激素的產(chǎn)生具有重要作用，由此支持大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的功能。
在體內(nèi)，gpc 最重要的生理功能在于穿過血腦屏障，為乙酰膽堿和磷脂( pc) 的合成提供必要的膽堿，乙酰膽堿是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)傳遞介質(zhì)，幫助腦部完成學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知活動(dòng)，且能控制淺睡眠和肌動(dòng)活動(dòng)。直接服用gpc，能夠促進(jìn)腦部磷酸肌醇的形成，并增加腦部磷脂的合成數(shù)量，為中樞神經(jīng)內(nèi)的信號(hào)傳遞提供更多的磷脂化合物，增加體內(nèi)磷脂酰膽堿的合成數(shù)量，有助于抵抗年齡增長而引起的細(xì)胞膜受損和末梢神經(jīng)功能的衰退。gpc 在意大利上市，近幾年，gpc 在我國引起越來越多的關(guān)注。
二、理化性質(zhì)
gpc分子式為c8h20no6p，可與水混溶，能溶于甲醇、乙醇，不溶于氯仿、醚、油等，在紫外可見光下無特征吸收。gpc 含量測(cè)定方法有高效液相色譜法( 配備蒸發(fā)光散射檢測(cè)器或折光示差檢測(cè)器) 和消化定磷法。常用的別方法有tlc 法( 展開劑為： v( ch2cl2) ∶ v( h2o) ∶ v( 三乙胺) = 35 ∶ 60 ∶ 5或v ( chcl3) ∶ v ( ch3oh ) ∶ v ( ch3cooh ) ∶v( ch3ch2cho) ∶ v( h2o) = ( 45∶ 25∶ 7∶ 4∶ 2) ) 、化學(xué)鑒別法( 配制5% 的gpc 供試品溶液，加入一定量的氫氧化鈉溶液和高錳酸鉀溶液，加熱，有類似三甲胺臭氣產(chǎn)生，此氣體使?jié)駶櫟募t色石蕊試紙變藍(lán)) 和紅外吸收光譜圖鑒別法。采用核磁共振譜對(duì)gpc 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，得到了gpc 的h 譜、c 譜、dept 譜、hsqc 譜、cosy 譜、hmbc 譜以及p譜的檢測(cè)數(shù)據(jù)，得到gpc 的結(jié)構(gòu)及化學(xué)位移歸屬見圖。
三、安全性
甘油磷酸膽堿是人體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)，在2009年的《突變研究》雜志刊登了480 種測(cè)試銷售藥物的遺致癌性和遺傳毒性，甘油磷酸膽堿列于“ 沒有檢索到數(shù)據(jù)的藥品”類。它不具有生殖毒性、遺傳毒性和致癌性。在對(duì)2 000 多例患者進(jìn)行臨床前試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)總共出現(xiàn)了不良反應(yīng)40 多例（ 2.14%），本品的臨床不良癥狀主要有：胃有灼熱感、興奮、失眠、頭痛；個(gè)別患者出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、意識(shí)模糊、頭暈、猝倒等癥狀；但總體看來甘油磷酸膽堿的安全性良好。
四、耐受性
根據(jù)多個(gè)中心的臨床試驗(yàn)使用甘油磷酸膽堿對(duì)阿爾茨海默氏癥和多發(fā)性腦梗死性癡呆患者進(jìn)行分別研究治療。甘油磷酸膽堿治療阿爾茨海默氏癥療程為180 d，每次0.4 g，每天服用3 次藥。結(jié)果顯示，甘油磷酸膽堿治療阿爾茨海默氏癥療效明顯，并且患者對(duì)于甘油磷酸膽堿的耐受性較好；甘油磷酸膽堿在治療多發(fā)性腦梗死性癡呆方面的研究，在對(duì)120 多例輕度病情的多發(fā)性腦梗死性癡呆患者進(jìn)行試驗(yàn)，療程為80 d，每同肌肉注射甘油磷酸膽堿1 g。
結(jié)果顯示甘油磷酸膽堿對(duì)于多發(fā)性腦梗死性癡呆，患者的耐受性較好。使用甘油磷酸膽堿治療腦缺血性中風(fēng)、輕度多發(fā)性腦梗死型癡呆、輕度阿爾茨海默癥，無局部或者全身的重大不良反應(yīng)。沒有臨床上和統(tǒng)計(jì)上的生命體征（舒張壓、收縮壓和心率）也沒有任何實(shí)驗(yàn)室檢查參數(shù)的明顯變化。所以，甘油磷酸膽堿的耐受性良好。
五、生物學(xué)功能
甘油磷酸膽堿不僅是腎髓質(zhì)細(xì)胞的主要滲透物之一，而且能夠平行的改變細(xì)胞內(nèi)外滲透物質(zhì)的濃度。這對(duì)于腦血管的健康，尤其是有益于因大腦衰退而引起的行為和情感障礙。甘油磷酸膽堿具有對(duì)于多種生化病變進(jìn)行治療和預(yù)防的潛在能力。研究人員發(fā)現(xiàn)它可以改變神經(jīng)元膜中的磷酸鹽類脂化合物結(jié)構(gòu)，并且在引發(fā)神經(jīng)組織衰退綜合癥的相關(guān)因素中發(fā)現(xiàn)它具有緩解身體緊張性的奇特功效。
甘油磷酸膽堿的理化結(jié)構(gòu)以及相互聯(lián)系的理化特性，確保了它成為非常對(duì)腦組織有益的、能時(shí)刻保護(hù)腦組織新陳代謝的磷脂類物質(zhì)。乙酰膽堿可幫助腦部完成記憶、學(xué)習(xí)等活動(dòng)。在體內(nèi)，甘油磷酸膽堿可穿過血腦屏障，這種生理生化特性為乙酰膽堿的生物合成提供了必要的原料—膽堿?！?膽堿能損傷假說”，認(rèn)為膽堿能的活性喪失與阿爾茨海默氏癥的嚴(yán)重程度有關(guān)。
六、用途
甘油磷酸膽堿已經(jīng)在意大利、波蘭、希臘、智利、韓國、巴西、俄羅斯等國家上市。它不僅能夠提供腦細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞所需要的高水平膽堿，而且還能保護(hù)其細(xì)胞壁。阿爾茲海默癥患者主要表現(xiàn)為記憶力與認(rèn)知功能下降，并且伴有多種并發(fā)癥，如行動(dòng)不便、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等功能性障礙。臨床的藥理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果和臨床試驗(yàn)都已證實(shí)甘油磷酸膽堿對(duì)大腦的認(rèn)知能力和記憶功能大有幫助。
甘油磷酸膽堿可以延緩記憶力的衰退，對(duì)于腦部中風(fēng)、顱與腦部損傷患者的康復(fù)與預(yù)防。由于年齡的增長而致使人腦的細(xì)胞膜受損，當(dāng)體內(nèi)乙酰膽堿和磷脂酰膽堿的合成數(shù)量增加了，情況就會(huì)得到改善。甘油磷酸膽堿能夠進(jìn)入脂蛋白結(jié)構(gòu)中，它不僅可以口服還可以靜脈注射。醫(yī)藥動(dòng)力學(xué)研究證明，甘油磷酸膽堿能在靜脈注射和小腸的位置被吸收，再經(jīng)過血液循環(huán)進(jìn)入到各個(gè)器官之中，并在肝臟中結(jié)合脂蛋白。它在青少年身體成長、保護(hù)肝臟、抗類風(fēng)濕、改善老年人的認(rèn)知能力、抗動(dòng)脈硬化、抵抗高脂蛋白食物的脂肪滲透、提高記憶力等方面也具有一定的作用。
七、制備方法
目前，國內(nèi)外關(guān)于gpc 的制備方法有動(dòng)物器官直接萃取法、化學(xué)合成法、化學(xué)水解法、磷脂酶水解法。
1）動(dòng)物器官直接萃取法
為了得到gpc，用了從牛胰臟中提取的方法。將牛胰臟破碎，取0.5 g 牛胰臟組織液，加入2 ml 純凈水，得到組織懸浮液，再加入40 ml 氫氧化鈉溶液( 0.1 mol /l)，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入無水乙醇與( 體積比3∶ 1) 進(jìn)行萃取，分離層，得到無水乙醇萃取物，煮沸后，過濾。濾液加入石油醚進(jìn)行二次萃取，分離，將無水乙醇中的萃取物抽濾，烘干，得到gpc 粗品。該方法操作工藝復(fù)雜，且產(chǎn)品收率低，已被其他方法所代替。
2）化學(xué)合成法
應(yīng)用環(huán)氧開環(huán)反應(yīng)原理，提出用( ｒ)-( + ) 縮合甘油( ( ｒ)-( + ) glycidol) 與磷酸膽堿在異丙胺存在下進(jìn)行親核加成，再經(jīng)過離子交換樹脂層析制備gpc，該工藝方法簡潔，但總收率低于50%，鑒于縮水甘油( 2，3-環(huán)氧-1-丙醇) 不穩(wěn)定需冷凍保存以避免自身縮合，使用前必須測(cè)定其純度，通常還要減壓蒸餾純化。將2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷雜環(huán)戊烷在0 ～ 10℃下在惰性溶劑中與異亞丙基甘油縮合；得到的縮合物與三乙胺在室溫下開環(huán)縮合，得到gpc 粗品； 再經(jīng)陽離子交換樹脂濃縮，然后結(jié)晶，得gpc。
3）化學(xué)水解法
采用醇解蛋黃磷脂制備gpc，旋蒸除去溶劑，再用進(jìn)行萃取，得到gpc 與甘油磷酰乙醇胺的混合物，然后用硅膠柱進(jìn)行純化，得到精制gpc。以四丁基氫氧化銨為催化劑水解卵磷脂，得到較純的gpc，但是需要除去催化劑，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行重結(jié)晶純化，整個(gè)過程較復(fù)雜，成本較高。利用卵磷脂水解法制備gpc，利用沉淀副產(chǎn)物以達(dá)到純化gpc 的目的，過量的汞離子通過硫化氫和碳酸鋇除去，這種方法效率較低，得到的gpc 不僅含有未反應(yīng)的卵磷脂，還殘留了大量有毒的汞離子。
采用將蛋黃卵磷脂溶于中，在室溫下攪拌2 h，生成的沉淀用洗滌后，溶解在甲醇中，加入硅藻土，制成gpc 硅藻土混合粉末，將該粉末與4-二甲基氨基吡啶混合，加入氯仿，在冰水浴中冷卻，50℃超聲破碎48 h，過濾除去硅藻土，上清液濃縮后經(jīng)過硅膠柱，得到的有效成分用hodamine 6g 和dittmerlester-reagent 噴射顯色后，濃縮，上葡聚糖凝膠柱純化，得高純度的gpc。
4）磷脂酶水解法
采用酶水解法制備gpc，屬于脂質(zhì)開發(fā)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。其采用在水相體系中以磷脂酶a1 水解大豆粉末磷脂制備gpc，gpc 得率達(dá)到95%。用lipozyme im 和磷脂酶a2 在微乳體系中共同催化水解磷脂酰膽堿48 h 制備gpc，其產(chǎn)率達(dá)94%，此法用雙酶催化，成本較高，且反應(yīng)時(shí)間很長；利用磷脂酶a1 催化pc80水解，24 h 后產(chǎn)物gpc 產(chǎn)率為86%。采用吸附法制備固定化磷脂酶a1 催化磷脂酰膽堿制備gpc，該方法gpc 產(chǎn)率可達(dá)85%，此法提高了磷脂酶a1 的貯存穩(wěn)定性，簡化了分離純化過程，且實(shí)現(xiàn)了酶的多次重復(fù)利用。