我們先來看一張圖
通過一張直觀的圖來探討今天的話題
這三張色譜圖的條件如下：
測試物質(zhì)為c1-c10的烷基胺同系列衍生的衍生的亞奈基苯并咪唑胺黃酰
這三張色譜圖給您的直觀感覺是什么？
●a圖等度洗脫，95：5的甲醇水，10個(gè)峰在10min出峰，峰很尖銳（窄），可是基線不分離。
●b圖等度洗脫，80：20的甲醇水，10個(gè)峰在50min出峰，后面的峰明顯展寬，峰矮胖。
●c圖梯度洗脫，所有物質(zhì)在20min出峰，分離度和響應(yīng)都良好。
這三張圖看完后，您是否有如下疑問？
●等度洗脫，要么幾個(gè)峰分不開，要么分開了，時(shí)間長，出現(xiàn)矮胖峰，等度洗脫不適合多組分分離嘛，同行告訴我多組分一般要使用梯度洗脫，這是為什么？
●梯度洗脫是怎么實(shí)現(xiàn)化合物在好的分離度下，又保持色譜峰不展寬，出現(xiàn)尖銳的色譜峰的？
●怎么設(shè)置梯度，怎么確定一個(gè)好的梯度洗脫方法？
為了解決大家的困惑，
我們今天就是要來探討，
為什么多組分要使用梯度法，
梯度洗脫怎么優(yōu)化。
對(duì)于多組分的檢測，我們希望什么？
1、良好的分離度
2、好的響應(yīng)，峰高和峰面積，色譜不展寬，得到窄的色譜峰。
首先，我們來看看影響色譜分離度的因素是什么？
這里給大家放上一個(gè)分離度的關(guān)系式：
式子中的r為分離度，k為容量因子，a為分離因子。
我們來回顧一下基本知識(shí)：
tm為不被固定相保留的死時(shí)間，
tr為化合物的保留時(shí)間（從進(jìn)樣到出現(xiàn)濃度大值的時(shí)間），
tr’為化合物的調(diào)整保留時(shí)間。
容量因子：是化合物在液-固兩相達(dá)到分配平衡時(shí)，組分在固定相與流動(dòng)相中的質(zhì)量比值，因此又被稱為質(zhì)量分配系數(shù)。
分離因子：分離因子是在同一色譜系統(tǒng)條件下保留的差異的量度
當(dāng)α=1時(shí)，兩個(gè)色譜峰具有相同的保留時(shí)間并共流出。
對(duì)于多組分，我們需的是，在一定的時(shí)間內(nèi)將組分分離，并且得到一定的色譜寬度的峰（尖峰）；那么想要良好的分離度，需要的是相鄰的兩個(gè)化合物能達(dá)到基線分離，首先看一下分離度公式，看看什么影響分離度：
其中：；我們可以看到，在同一色譜系統(tǒng)，兩個(gè)化合物的分離因子，與此色譜系統(tǒng)下，化合物自身特性相關(guān)，當(dāng)α越大，分離度也將越大。
而其中：
可見，k’增大，可以提高分離度。
我們知道，梯度洗脫程序在改變流動(dòng)相的比例，以達(dá)到分離的目的，那么梯度洗脫究竟是怎么來影響分離度的呢？
我們以反相色譜系統(tǒng)為例，來看一下，當(dāng)我們改變了流動(dòng)相比例時(shí)，k’的變化情況。
這是一張反相色譜圖中，化合物的lgk’與流動(dòng)相中有機(jī)相比例的關(guān)系圖，近似為線性的關(guān)系圖。從這張圖，可以看出，在反相色譜中，lgk’隨著ψ比例增大，逐漸降低，k’也逐漸減小。
即: lgk’ =aψ+b (a為曲線的斜率，b為截距）。
通過這張圖，我們來說明為什么需要梯度洗脫，
對(duì)于化合物1，2
ψ=0.45時(shí)，lgk1’ =0.97，k1’=9.33；
lgk2’=1.27, k2’=18.6;
如果我們使用等度洗脫，有機(jī)相的比率為45%，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)，由于此時(shí)的k1’=9.33， k2’=18.6，k’都大于10，這個(gè)時(shí)候，化合物與固定相作用的時(shí)間較長，因此可以想象，在這個(gè)時(shí)候化合物1，和化合物2 出峰時(shí)間都比較靠后，而且由于強(qiáng)的作用力，導(dǎo)致流動(dòng)相無法在一個(gè)短的時(shí)間內(nèi)將化合物洗脫出來，因此峰都變得比較矮胖，也就是寬峰，如圖：
對(duì)于化合物1，2
ψ=0.65時(shí)，lgk1’ =-0.21，k1’=0.61；
lgk2’=-0.35, k2’=0.44;
如果我們使用等度洗脫，有機(jī)相的比率為65%，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)，由于此時(shí)的k1’=0.61， k2’=0.44，k’都接近于0，此時(shí)化合物會(huì)被流動(dòng)相快速帶出，形成尖峰，但由于兩個(gè)化合物得k'都很小，而且接近，會(huì)形成共流出物，而且，第yi個(gè)峰出峰時(shí)間hao大于2tm（k’=0)值，反映得圖如下：
那么如果是梯度洗脫，會(huì)怎么樣呢：
在梯度洗脫過程中，k’的值會(huì)隨流動(dòng)相的變化而改變，化合物被流動(dòng)相洗脫帶出色譜柱到達(dá)檢測器的保留時(shí)間，與化合物從進(jìn)樣開始，到流出色譜柱的這一段時(shí)間內(nèi)平均的k’的大小，以及色譜柱長，流動(dòng)相的流速等有關(guān)，而化合物是否能產(chǎn)生窄的色譜峰，則取決于物質(zhì)在將要脫離色譜柱的時(shí)候，k’能否比較?。磁c固定相的作用力足夠小，能被快速?zèng)_洗出去）。
打一個(gè)比方：
一輛汽車和一輛摩托車，通過一個(gè)長度為lkm的隧道，汽車初始速度為20km/h，摩托車的初始速度為35km/h,汽車的加速度為1.5m/s2，摩托車的加速度為0.8m/s2，那么誰將先通過隧道，汽車能否實(shí)現(xiàn)超車？
其實(shí)如果隧道足夠短，由于初始由于摩托車速度快，雖然加速度小，但是汽車整體的移動(dòng)速度仍然小于摩托車，汽車的平均速度就小于摩托車的速度，在這個(gè)整體水平上，汽車就會(huì)比摩托車慢到達(dá)，例如：當(dāng)l=100m時(shí)，汽車通過的時(shí)間為8.42s，摩托車通過的時(shí)間為7.78s。
相反，如果隧道足夠長，那么汽車在這段距離上的平均車速就比摩托車快，那么汽車就能實(shí)現(xiàn)彎道超車，例如當(dāng)l=1000m時(shí)，通過隧道的時(shí)間，摩托車為39.3s；而汽車為33s。
這個(gè)比方里面的長為l的隧道（不同的隧道長度反映了車子通過隧道的加速時(shí)間的長短，導(dǎo)致終通過隧道的平均速度不一樣），這個(gè)就相當(dāng)于色譜柱長，初始速度就相當(dāng)于初始流動(dòng)相比例下的化合物的k’，加速度就相當(dāng)于lgk’與ψ線性曲線的曲線斜率，我們通常說色譜柱柱子長度是一定的，流動(dòng)相在梯度變化的過程中，在這個(gè)時(shí)間段內(nèi)，那么相同的柱子長度，k’變化的速率不同（就如同車子的加速度一樣），在整個(gè)色譜行為上的平均值k’（如同車子在通過隧道的平均速度v’），就不一樣，如果在梯度變化的時(shí)間范圍內(nèi)，通過相同的色譜柱，k’的平均值越小，就越容易先被洗脫出色譜柱，因此我們不能光關(guān)注化合物的初始k’，還需要關(guān)注化合物的k’的變化速率，這就很好的解釋了，為什么有的物質(zhì)在同一根色譜柱上，在a梯度時(shí)，化合物x比化合物g先出峰，而在另外一個(gè)梯度時(shí)，卻是g先出峰（形勢發(fā)生了逆轉(zhuǎn)）。終誰先出峰，與這些因素有關(guān)，另外當(dāng)接近隧道出口時(shí)，若汽車速度加到越快（相對(duì)于化合物的k’越小），那么汽車或者摩托車整體通過隧道的時(shí)間就越短（t=車身長度/車速），對(duì)應(yīng)于此時(shí)化合物出峰的色譜峰寬度就越窄。
例如，車身長為2.5m，如果終通過隧道時(shí)車速為23m/s,則汽車*通過隧道的時(shí)間為：0.10s，如果這時(shí)候車速為15m/s，則汽車*通過隧道的時(shí)間為：0.16s，我們看到，出隧道時(shí)，車速越快，車子通過隧道的時(shí)間越短，反映在色譜上，就是峰的寬窄了。色譜峰流出的峰寬度反映在色譜圖上的寬度即t1-t0。
總結(jié)
1、對(duì)于容量因子k’范圍很大的化合物組，分離可以優(yōu)先考慮梯度洗脫。
2、多組分的分離策略，考慮合適的分析時(shí)間內(nèi)，得到窄峰和好的分離度
3、梯度洗脫是利用變化的有機(jī)相比例，即強(qiáng)度不同，達(dá)到改變化合物在兩相中的作用力大小。
4、lg k’與ψ近似線性關(guān)系
5、k’隨ψ的變化趨勢的不同，使得梯度洗脫將不同化合物在色譜上的保留時(shí)間差異拉大，甚至出現(xiàn)超車。
6、k’≈0時(shí)，化合物幾乎與固定相無作用力，能快速通過色譜柱，產(chǎn)生尖峰。