car-t與溶瘤病毒的聯(lián)合使用
改造的t細(xì)胞在血液惡性腫瘤的過繼細(xì)胞*中顯示出了顯著療效。然而，在實(shí)體瘤治療中成功案例較少。溶瘤病毒(ovs)具有特異性裂解腫瘤細(xì)胞以及通過破壞血管間接抑制腫瘤生長的能力。這些抗腫瘤能力在全身給藥時(shí)與淋巴細(xì)胞相關(guān)，故需要高劑量給藥以逃避抗體和免疫系統(tǒng)其他部分的攻擊。t細(xì)胞可以自由在體內(nèi)通行，使用這些細(xì)胞將ovs直接遞送到腫瘤組織可能會是一個(gè)很理想的方案。在小鼠和人t細(xì)胞中，作者研究表明car-t細(xì)胞負(fù)載低劑量病毒不會影響受體的表達(dá)和功能。改造的t細(xì)胞可以將病毒富集到多種腫瘤細(xì)胞靶標(biāo)上，以提高聯(lián)合療法的抗腫瘤活性。這一方法可以廣泛使用，因?yàn)樽髡咴诟腥緍na或dna病毒的鼠或人t細(xì)胞上觀察到類似的結(jié)果?？偠灾?，改造的t細(xì)胞裝載ov可能是一種能提高療效的新的聯(lián)合療法。
前言
溶瘤病毒(ovs)能夠選擇性感染腫瘤細(xì)胞，并在其中復(fù)制并殺傷腫瘤細(xì)胞，而不會傷及健康組織。此外，這些病毒可以誘導(dǎo)強(qiáng)力的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤反應(yīng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)皰疹性口腔炎病毒(vsv)具備這一屬性。m蛋白(vsvδm51)突變增強(qiáng)了這種病毒的干擾素敏感性，同時(shí)顯著增強(qiáng)了其安全性和腫瘤趨向性。牛痘病毒(vv)已廣泛用在臨床前模型和臨床試驗(yàn)，病毒的全身治療結(jié)果顯示是安全的。作者對胸苷激酶和病毒生長因子基因缺失的這種雙重缺失型重組牛痘病毒很感興趣。這種病毒腫瘤趨向性增強(qiáng)，并且在靜止期細(xì)胞內(nèi)復(fù)制受限。
關(guān)于vv全身給藥的臨床試驗(yàn)給予高劑量病毒的取值范圍在每例患者1×105到3 × 107 pfu/kg。迄今為止臨床試驗(yàn)中vsv的使用仍然受限，在動物試驗(yàn)中每只小鼠通常采用高于5 × 108pfu的劑量，表明了人體中使用的劑量也可相當(dāng)高。據(jù)推測靜脈給予這么高劑量的病毒是因?yàn)槎鄠€(gè)血源性防御機(jī)制會消滅病毒，如補(bǔ)體，抗體，免疫細(xì)胞，所以需使用飽和劑量突破防御機(jī)制使病毒能轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤。
過繼細(xì)胞治療(act)已成為某些種類的癌癥有效的治療方法，包括黑色素瘤的腫瘤侵潤t淋巴細(xì)胞治療和惡性血液腫瘤的改造t細(xì)胞治療。act研究的成功證明，t細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移使t細(xì)胞遷移至腫瘤位點(diǎn)以發(fā)揮抗腫瘤作用。有趣的是，ovs發(fā)現(xiàn)與外周血淋巴細(xì)胞如b細(xì)胞有天然的關(guān)聯(lián)。因此在過繼細(xì)胞治療前將淋巴細(xì)胞負(fù)載ovs受到關(guān)注。這種方式裝載ovs的淋巴細(xì)胞可以將ov輸送到腫瘤部位。的確，前期的報(bào)道顯示在轉(zhuǎn)基因小鼠中t細(xì)胞可以轉(zhuǎn)運(yùn)ov到成瘤部位，并且這一組合可以導(dǎo)致腫瘤排斥反應(yīng)。裝載vsv到t細(xì)胞中可以保護(hù)病毒避免與抗體中和，并保持其抗腫瘤功效。同樣，vv可以利用細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞在腫瘤內(nèi)有效攜帶和積蓄，引發(fā)再次抗腫瘤效應(yīng)。在嵌合抗原受體(cars)改造的t細(xì)胞過繼輸注的臨床試驗(yàn)中看到了具有前景的治療效果，作者感興趣的是確定是否car-t細(xì)胞可裝載ov并保持抗腫瘤活性，從而有效的構(gòu)建雙重抗腫瘤活性制劑。在這篇文章中，作者證明vsvδm51和vvdd可以成功地加載到小鼠和人car-t細(xì)胞，并且不會影響car的表達(dá)，活力或功能。作者的數(shù)據(jù)還進(jìn)一步表明，ov-car-t細(xì)胞是能夠?qū)⒉《靖患降侥[瘤靶點(diǎn)，并且該組合具有增強(qiáng)兩者單一療效的潛力。這些數(shù)據(jù)為未來兩種治療的結(jié)合應(yīng)用提供依據(jù)。
結(jié)果
car-t細(xì)胞負(fù)載ov不影響car的表達(dá)
首先作者要確定car-t細(xì)胞負(fù)載ov組合的可行性以及研究中使用病毒的感染復(fù)數(shù)(moi)。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)car-'ve的小鼠t細(xì)胞(避免car的潛在影響)，在moi值為0.3，1和3負(fù)載vsvδm51-gfp和vvdd-gfp murine (圖1a)。作者預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，vsvδm51-gfp和 vvdd-gfp負(fù)載改造的t細(xì)胞在moi值為3時(shí)在腫瘤靶標(biāo)上的沉積水平高，以及重復(fù)性相對要高(圖1a)。在用慢病毒改造的人t細(xì)胞測試得出了相同的結(jié)果，即在moi值為3時(shí)病毒沉積水平高(圖1b)?；谶@些結(jié)果，在隨后的實(shí)驗(yàn)中所有t細(xì)胞和病毒使用這一moi值。
接下來作者測試負(fù)載ov是否會對t細(xì)胞造成影響。moi值為3使用vsvδm51-gfp和vvdd-gfp負(fù)載改造的t細(xì)胞。在洗滌后，將細(xì)胞培養(yǎng)，并進(jìn)行病毒復(fù)制，或car的表達(dá)或功能改變的分析。在這些研究中所用的her-car示意圖在附件圖s1中。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測攜有g(shù)fp病毒感染的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)感染vsvδm51-gfp和vvdd-gfp的一小部分小鼠t細(xì)胞(圖2a，b；附件圖s2a)中cd4+cd8+亞群gfp表達(dá)水平相近。作者繼續(xù)研究ov的負(fù)載對car表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)負(fù)載任一ov后對car的表達(dá)水平?jīng)]有影響(圖2c，附件圖s1b)。
圖1：ov負(fù)載的劑量。根據(jù)vsvδm51-gfp 或vvdd-gfp的moi負(fù)載car陰性(car-'ve)改造的小鼠(a)或人(b)t細(xì)胞，洗脫，并與d2f2 腫瘤細(xì)胞孵育以測試ov沉積。通過image quant軟件測定相對熒光，至少重復(fù)3次作平均值±sem。car，嵌合抗原受體； moi，感染復(fù)數(shù)； ov，溶瘤病毒； vsv，水泡性口炎病毒； vvdd，雙刪除痘苗病毒。
下面作者測試人car-t細(xì)胞裝載ov的能力。作者使用攜有人her2-car的慢病毒(或car-'ve對照)改造t細(xì)胞并使用vsvδm51-gfp或 vvdd-gfp進(jìn)行負(fù)載。有趣的是作者觀察到car-'ve和 her2-car-t細(xì)胞中vvdd-gfp復(fù)制水平較高，負(fù)載后72小時(shí)gfp陽性細(xì)胞大約為12%(圖2d，e和3b；附件圖s2b)。與之相反，vsvδm51-gfp負(fù)載細(xì)胞在負(fù)載7天后gfp陽性細(xì)胞從未超過2%(圖2d，e和3b)。ov負(fù)載后至少在5天中，人car-t細(xì)胞中病毒復(fù)制的增加沒有導(dǎo)致t細(xì)胞活性的改變；僅在vvdd-gfp負(fù)載7天后觀察到細(xì)胞活性明顯下降(圖3a)。另外，正如同鼠t細(xì)胞，ov的負(fù)載沒有導(dǎo)致人t細(xì)胞car表達(dá)的任何變化(圖2f；附件圖s1b，c)。在負(fù)載至少7天后cd4+或cd8+t細(xì)胞car都保持穩(wěn)定表達(dá)(附件圖s1；圖3c，d)。病毒感染(經(jīng)gfp陽性信號檢測)并不局限于car陽性或陰性亞群，作者在兩個(gè)亞群中檢測到gfp相同的水平(如果沒有在car陽性細(xì)胞中高表達(dá))，這表明ov沒有發(fā)生區(qū)別性負(fù)載(附件表s1)。在cd4 +和cd8 + t細(xì)胞中衡量gfp的表達(dá)(補(bǔ)充圖s2d)。作者在人her2-car-t細(xì)胞中負(fù)載每一種ov并且通過流式細(xì)胞術(shù)對cd3+細(xì)胞進(jìn)行純化，以確認(rèn)ovs在car陽性t細(xì)胞亞群中被攜帶(補(bǔ)充圖s4)。病毒滴定分析證實(shí)cd3+ car-t裝載有復(fù)制能力的病毒(附件表s3)。本文原創(chuàng)編譯愛康得paul認(rèn)為這些數(shù)據(jù)表明ov的裝載不影響改造的t細(xì)胞表明car的表達(dá)。
car-t細(xì)胞顯示出具備ov裝載的能力。接下來作者試圖確定car-t功能是否受裝載ov的影響。作者將小鼠car-t細(xì)胞裝載ov并用her2-fc刺激4小時(shí)，隨后使用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞因子進(jìn)行檢測。不管是負(fù)載了vsv還是vvdd的小鼠t細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)水平都出現(xiàn)不明顯的輕微下降(圖4a)。在car的作用下應(yīng)答性t細(xì)胞產(chǎn)生干擾素γ(ifnγ)和腫瘤壞死因子α(tnfα)(圖4a)。為了評估加載和不加載ov的t細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷能力，將不同效靶比的t細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)6小時(shí)，使在短期培養(yǎng)中潛在的病毒介導(dǎo)的殺傷作用小化。的確，ov的加載并沒影響到car-t的能力，其有效的對her2+靶細(xì)胞(d2f2/e2)進(jìn)行殺傷而對 her2-'ve d2f2細(xì)胞沒有影響(圖4b)。
圖2：ov的負(fù)載不影響car的表達(dá)。car-'ve和her2-car改造的小鼠(a-c)或人(d-f)t細(xì)胞負(fù)載vsvδm51-gfp或vvdd-gfp，洗滌并分析前孵育。(a-b)通過gfp+流式信號檢測，vsvδm51-gfp或vvddgfp負(fù)載小鼠(a-b)t細(xì)胞后復(fù)制量小。數(shù)據(jù)取自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的典型圖或±sem。*p < 0.05， n.s. =不顯著。(c)在ov負(fù)載后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測her2-fc嵌合體來評估car的表達(dá)(cd8+細(xì)胞門控)。結(jié)果取三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的±sem。(d，e)vsvδm51-gfp或vvdd-gfp負(fù)載人t細(xì)胞后復(fù)制水平較低。數(shù)據(jù)取自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的典型圖或±sem。*p < 0.05， n.s. =不顯著。(f)根據(jù)上述評價(jià)方法(門控cd8 +細(xì)胞)car的表達(dá)不受ov負(fù)載的影響。結(jié)果取自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的±sem。car，嵌合抗原受體； moi，感染復(fù)數(shù)； ov，溶瘤病毒； vsv，水泡性口炎病毒； vvdd，雙刪除痘苗病毒。
大多數(shù)情況下，ov的裝載不會影響car刺激下表達(dá)細(xì)胞因子的能力(圖3e和4c)。重要的是，ov的加載car-t細(xì)胞仍保持特異性殺傷her2+靶細(xì)胞的能力，這表明任意細(xì)胞因子的減少不會危及到其裂解細(xì)胞的能力(圖4d)。cd4+t細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子只會在vsvδm51-gfp的裝載后瞬時(shí)下降，并且在ov裝載后的48小時(shí)內(nèi)得到恢復(fù)(圖3e)。早期cd4+t細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)下降主要是因?yàn)閠nfα表達(dá)的改變和ifnγ 表達(dá)的微弱變化(附件圖s3a，b)。vsvδm51-gfp的裝載沒有影響到cd8+t細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子(圖3f；附件圖s3c)。由于vsv裝載后gfp+細(xì)胞量較少，故無法評估vsv直接感染t細(xì)胞對t細(xì)胞功能產(chǎn)生的影響。vvdd的裝載(通過gfp顯示)影響了cd4+ 和cd8+ her2-car-t細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)水平，但是，細(xì)胞仍可以通過car和細(xì)胞因子的表達(dá)對靶抗原產(chǎn)生應(yīng)答(附件表s2和圖s3b，c)。在vvdd-gfp裝載后的幾天里cd8 + t細(xì)胞介導(dǎo)的ifnγ和tnfα的表達(dá)顯著降低(圖3f)。這是由于gfp+亞群的功能減弱(附件表s2)，并且恰好處于car-t細(xì)胞中病毒復(fù)制的增加(圖3b)。總之，本文原創(chuàng)編譯paul認(rèn)為該數(shù)據(jù)表明，改造的t細(xì)胞可以加載ov，并且不會導(dǎo)致car-t細(xì)胞功能障礙。
圖3：隨著時(shí)間的推移，ov負(fù)載的car-t細(xì)胞的t細(xì)胞活力，car表達(dá)或功能變化微小。人her2-car-t細(xì)胞或car-'ve對照以moi為3用vsvδm51-gfp和vvdd-gfp負(fù)載7天后通過流式細(xì)胞術(shù)評估(a)可行性，(b)病毒的復(fù)制，(c)cd8 + t細(xì)胞car表達(dá)，(d)cd4+ t細(xì)胞car表達(dá)，或細(xì)胞因子的產(chǎn)生(ifnγ和/或tnfα陽性細(xì)胞)(e)的cd4 +或(f)cd8 + t細(xì)胞。數(shù)據(jù)取自兩組獨(dú)立的t細(xì)胞供體的±sem。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， n.s. = 無明顯差異。car，嵌合抗原受體； moi，感染復(fù)數(shù)； ov，溶瘤病毒； vsv，水泡性口炎病毒； vvdd，雙刪除痘苗病毒。
car-t細(xì)胞可以成功將ov轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞。為確定裝載ov的car-t細(xì)胞是否可以有效地將病毒沉積于腫瘤靶標(biāo)，將裝載vsvδm51-gfp和vvdd-gfp的car-'ve或her2-car-t細(xì)胞，與不攜帶her2不會受到car影響的乳腺癌d2f2細(xì)胞以1：1的比例共培養(yǎng)。24小時(shí)后使用typhoon成像儀通過gfp對病毒復(fù)制進(jìn)行評價(jià)(圖5)。作者觀察到car-'ve和her2-car-t細(xì)胞成功將vsvδm51-gfp以相同效率轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤靶標(biāo)(圖，c)。事實(shí)上，小鼠和人的car-t細(xì)胞在單細(xì)胞層內(nèi)表現(xiàn)出相似的復(fù)制模式(圖，c左邊小圖)。這一模式意味著病毒會特異性侵襲病灶部位并蔓延至整個(gè)單細(xì)胞層(圖5)。這進(jìn)一步證明病毒自身可在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制而不是簡單的以1：1比例培養(yǎng)感染細(xì)胞。
圖4：ov的負(fù)載不影響car-t細(xì)胞的功能。car-'ve和her2-car改造的小鼠(a，b)或人(c，d)t細(xì)胞負(fù)載vsvδm51-gfp或vvdd-gfp，洗滌并在功能檢測前孵育。將ov負(fù)載的t細(xì)胞在布雷菲德菌素a中her2-fc包被的培養(yǎng)板刺激4小時(shí)。細(xì)胞因子的分泌量介于模型和ov負(fù)載的t細(xì)胞之間(門控cd8+細(xì)胞)。(a)數(shù)據(jù)取自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的流程圖或(c)匯總。(b，d)模擬或ov負(fù)載的car-t細(xì)胞與d2f2或d2f2/e2腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)6小時(shí)。t細(xì)胞洗脫后，通過alamarblue法檢測腫瘤細(xì)胞的存活率。數(shù)據(jù)取自小鼠和人兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。car，嵌合抗原受體； moi，感染復(fù)數(shù)； ov，溶瘤病毒； vsv，水泡性口炎病毒； vvdd，雙刪除痘苗病毒。
作者也觀察到vvdd-gfp向腫瘤靶標(biāo)的成功轉(zhuǎn)運(yùn)(圖5b，d)。car-'ve和 her2-car-t細(xì)胞沉積的vvdd-gfp的復(fù)制模式類似，這再次表明了病毒在單細(xì)胞層會特異性侵襲病灶。 (圖5b，d，左圖)。無論是使用car-'ve 還是car+細(xì)胞，都表明病毒在靶細(xì)胞中感染/復(fù)制模式基本相似?？偟膩碚f，作者的數(shù)據(jù)表明，car-t細(xì)胞可以作為ov有效的運(yùn)輸載體。
圖5：ov負(fù)載的car-t細(xì)胞可以將ov沉積到腫瘤細(xì)胞上。(a，b)小鼠或(c，d)人car-'ve或her2-car-t細(xì)胞在moi值0或3負(fù)載(a，c) vsvδm51-gfp或 (b，d) vvdd-gfp并與d2f2腫瘤靶標(biāo)共培養(yǎng)24小時(shí)。利用typhoon成像儀檢測gfp信號可視化病毒復(fù)制(左圖)。使用imagequant對病毒的復(fù)制水平進(jìn)行定量分析(右圖)。定量分析以±sem表示。*p < 0.05， **p < 0.01， n.s. =無明顯差異。數(shù)據(jù)取自小鼠和人細(xì)胞2-3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)3遍。car，嵌合抗原受體； moi，感染復(fù)數(shù)； ov，溶瘤病毒； vsv，水泡性口炎病毒； vvdd，雙刪除痘苗病毒。
car-t與腫瘤的相互作用不會影響ov沉積的能力
由于car的激活會分泌細(xì)胞因子如ifn-γ，這可能會影響病毒的復(fù)制，作者試圖確定是否car的活化會給病毒在腫瘤細(xì)胞上沉積帶來不利的影響。作者將加載了vsvδm51-gfp或vvdd-gfp的car-'ve或her2-car-t細(xì)胞與her2+ d2f2/e2細(xì)胞系以1：1的比例共培養(yǎng)24小時(shí)，通過gpf評價(jià)病毒的復(fù)制。作者觀察到無論是小鼠還是人car-t細(xì)胞在與腫瘤細(xì)胞相互作用下vsvδm51-gfp復(fù)制沒有差異(圖6a，c)。雖然her2-car-t組病毒量有降低的趨勢，但是her2-car介導(dǎo)的腫瘤靶細(xì)胞殺傷必須予以考慮，因?yàn)檫@降低了可被感染的靶細(xì)胞數(shù)目。關(guān)于vvdd-gfp的復(fù)制， her陰性靶標(biāo)和her陽性靶標(biāo)(圖5b，d)相比，vvdd-gfp復(fù)制似乎有微弱的下降(圖6b，d)。然而，her2-car-t細(xì)胞可能在病毒復(fù)制分析前就就對靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷，故難以界定是否對病毒感染造成損害或是否增加了腫瘤細(xì)胞的死亡?？傊髡邤?shù)據(jù)表明，car活化不顯著影響ov裝載的t細(xì)胞將病毒沉積于腫瘤靶標(biāo)的能力，也不顯著影響病毒在腫瘤靶標(biāo)內(nèi)的復(fù)制。
圖6：同源之間的相互作用不會影響car-t轉(zhuǎn)運(yùn)ov的能力。(a，b)小鼠或(c，d)人car-'ve或her2-car-t細(xì)胞在moi值0或3負(fù)載(a，c) vsvδm51-gfp或 (b，d) vvdd-gfp并與d2f2/ e2腫瘤靶標(biāo)共培養(yǎng)24小時(shí)。利用typhoon成像儀檢測gfp信號可視化病毒復(fù)制(左圖)。使用imagequant對病毒的復(fù)制水平進(jìn)行定量分析(右圖)。使用imagequant對病毒的復(fù)制水平進(jìn)行定量分析(右圖)。定量分析以±sem表示。*p < 0.05， **p < 0.01， n.s. =無明顯差異。數(shù)據(jù)取自小鼠和人細(xì)胞2-3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)3遍。car，嵌合抗原受體； moi，感染復(fù)數(shù)； ov，溶瘤病毒； vsv，水泡性口炎病毒； vvdd，雙刪除痘苗病毒。
ov裝載的t細(xì)胞可以增強(qiáng)對腫瘤的殺傷作用
為了評估ov負(fù)載的car-t細(xì)胞相對于car-t細(xì)胞殺瘤能力有所增強(qiáng)，作者在體外對3種不同的her2陽性腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)評估。3種細(xì)胞系her2表達(dá)水平不同(圖7a)，a549 her-2低表達(dá)，d2f2/ e2 her-2高表達(dá)，t47d her-2表達(dá)介于前二者之間。vsvδm51-gfp和 vvdd-gfp很容易在這些細(xì)胞系中復(fù)制，因?yàn)樵谶@些細(xì)胞與ov負(fù)載的car-t細(xì)胞共培養(yǎng)后很容易檢測到這些病毒的復(fù)制(圖7b)。在ov負(fù)載的car-t病毒沉積后這三種細(xì)胞系對vsvδm51-gfp表現(xiàn)出相似的易感水平(圖7b，中間列)。與此相反，通過car-t細(xì)胞病毒沉積后細(xì)胞系對vvdd易感似乎表現(xiàn)出較大差異，a549細(xì)胞比其他細(xì)胞系更加支持vvdd的復(fù)制。3種細(xì)胞系對car-t的殺傷敏感性有差異，a549不敏感， t47d 敏感，d2f2/e2介于兩者之間(圖7c-e， 空心圓)。利用car介導(dǎo)的殺傷與ov感染的敏感性差異，可以很好地評估car-t細(xì)胞負(fù)載ov這一組合對腫瘤細(xì)胞的效力。a549肺腺癌被證明對通過t細(xì)胞病毒沉積后vsv介導(dǎo)的溶瘤作用非常敏感，但未表現(xiàn)出car-t 細(xì)胞和ovs的聯(lián)合效應(yīng)(圖7c)。vvdd-gfp的沉積對a549細(xì)胞的活力沒有影響，盡管觀察到了病毒的復(fù)制(圖7b，右上正方形和圖7c，三角形)。雖然t47d表現(xiàn)出了通過car-'ve病毒沉積后sv和vvdd殺傷的敏感性，car-t強(qiáng)力穩(wěn)定的殺傷效果掩蓋了所有聯(lián)合效應(yīng)(圖7d)。作者發(fā)現(xiàn)通過car-'ve t細(xì)胞vsvδm51-gfp沉積對d2f2/e2乳腺癌細(xì)胞溶瘤作用相對溫和(圖7e，實(shí)心方塊)。如前所述，d2f2/e2細(xì)胞系對her2-car-t殺傷作用很敏感，并且殺傷作用沒有受到加載病毒的影響。有趣的是，作者確實(shí)觀察到加載了vsvδm51-gfp的her2-car-t細(xì)胞具有聯(lián)合殺傷作用(圖7e，空心方塊)?？偟膩碚f，ov負(fù)載car-t細(xì)胞不會影響car-t細(xì)胞單獨(dú)使用的功能，負(fù)載的病毒可有效殺傷那些對car-t耐受的靶標(biāo)。此外作者在對單獨(dú)使用其中之一方法都中度敏感的d2f2/ e2細(xì)胞系中也觀察到了聯(lián)合效果。
圖7：ov負(fù)載的car-t細(xì)胞可以增強(qiáng)對靶細(xì)胞的殺傷能力。人her2- car-t細(xì)胞(或car-'ve對照)負(fù)載vsvδm51-gfp或vvdd-gfp，moi值為3，并以不同效靶比與腫瘤靶標(biāo)共培養(yǎng)。(a)用抗人her2對鼠(d2f2和d2f2/ e2)和人(a549，t47d)腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行染色，隨后用抗人igg-pe處理并用流式檢測her2表達(dá)。(b)a549，t47d和 d2f2/e2對vsv或vvdd的復(fù)制表現(xiàn)了不同的易感性。用上述的ov負(fù)載的car-'ve細(xì)胞以1：1的效靶比與腫瘤靶標(biāo)共培養(yǎng)24小時(shí)，使用typhoon成像儀對各個(gè)孔進(jìn)行成像檢測。培養(yǎng)板代表2-3份獨(dú)立實(shí)驗(yàn)并重復(fù)3次。ov負(fù)載的t細(xì)胞與(c)a549， (d) t47d或(e) d2f2/e2腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。洗脫t細(xì)胞后通過alamarblue法測定腫瘤細(xì)胞的存活率。數(shù)據(jù)取自2-3份獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中3個(gè)孔重復(fù)的±sem。car，嵌合抗原受體； moi，感染復(fù)數(shù)； ov，溶瘤病毒； vsv，水泡性口炎病毒； vvdd，雙刪除痘苗病毒。
表1：vsv？m51-gfp和vvdd-gfp負(fù)載t細(xì)胞，moi值為3。t細(xì)胞搜集后測定其攜帶病毒的滴度。攜帶ov的t細(xì)胞和d2f2的腫瘤細(xì)胞以1：1的比例共培養(yǎng)24小時(shí)。收集上清液后測定其釋放病毒的滴度。利用瓊脂糖覆蓋的vero細(xì)胞測定vsv？m51-gfp滴度；利用cv-1細(xì)胞和結(jié)晶紫染色測定vvdd-gfp滴度。誤差表示為± sem。car，嵌合抗原受體； moi，感染復(fù)數(shù)； ov，溶瘤病毒； vsv，水泡性口炎病毒； vvdd，雙刪除痘苗病毒。
t細(xì)胞裝載的病毒一旦轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤靶標(biāo)即可迅速復(fù)制
為了更好的了解通過t細(xì)胞傳送的病毒復(fù)制情況，作者定量分析了負(fù)載于t細(xì)胞的病毒，然后測量病毒在感染腫瘤靶點(diǎn)24小時(shí)候的細(xì)胞上清液的病毒滴度。有趣的是作者發(fā)現(xiàn)car-t細(xì)胞負(fù)載的vsv？m51-gfp滴度非常低；約20-30pfum/1.25x105個(gè)car-'ve或her-2-car-t 細(xì)胞(表1)。但是vvdd-gfp可負(fù)載水平明顯更高，約0.5？1.2x104 pfu /1.25x105細(xì)胞。為了評價(jià)病毒與靶細(xì)胞共培養(yǎng)后的復(fù)制能力，作者將1.25 x105個(gè)負(fù)載ov的t細(xì)胞和1.25 x105d2f2腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。經(jīng)過24小時(shí)，作者搜集上清液并測定滴度。實(shí)驗(yàn)證明，共培養(yǎng)的vsv負(fù)載的car-t細(xì)胞，作者獲得了顯著增加的病毒數(shù)量：約2x107pfu(表1)。這相當(dāng)于增加了7.5x10^5倍的滴度，有效moi約0.0002。負(fù)載病毒的car-'ve 或 her2-car-t cells 的培養(yǎng)沒有顯著差異。作者進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)，用vvdd以moi值為0.04和0.1分別負(fù)載 her2-car和car-'ve-t細(xì)胞。病毒沉積24小時(shí)后上清液病毒滴度超過8.88×105 pfu。這相當(dāng)于t細(xì)胞病毒平均負(fù)載量的114倍。此外，car-'ve和her2-car-t細(xì)胞來源的vvdd-gfp病毒滴度沒有顯著差異?？傊髡叩臄?shù)據(jù)表明，ov負(fù)載car-t細(xì)胞這一組合可行，因?yàn)閠細(xì)胞可有效將病毒轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤靶標(biāo)，從而有助于提高這兩項(xiàng)治療方法的抗腫瘤效力。
討論
癌癥免疫療法是一個(gè)迅速增長的領(lǐng)域，單獨(dú)或聯(lián)合將t細(xì)胞，病毒，抗體用作治療進(jìn)步顯著。盡管act在血液惡性腫瘤顯示出顯著的療效，而實(shí)體腫瘤響應(yīng)水平較低。ovs是另一項(xiàng)充滿希望的治療手段，近期的3期研究中t-vec顯示出了持久的*或部分應(yīng)答。然而，許多ov依賴于瘤內(nèi)注射，這為轉(zhuǎn)移性疾病帶來困難，全身給藥需要很高的滴度，這增加了脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。本文原創(chuàng)編譯愛康得paul認(rèn)為這些療法都有相當(dāng)大的改進(jìn)余地。有少量報(bào)道提出了t細(xì)胞作載體負(fù)載ov這一概念，如小鼠t細(xì)胞或人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞。這些研究表明，小鼠t細(xì)胞可將ov轉(zhuǎn)運(yùn)并沉積到腫瘤靶標(biāo)上，顯示出了比任一的單一療法增強(qiáng)的效力。此外，小鼠和人cik細(xì)胞可成功將vvdd轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高了抗腫瘤功效。改造的t細(xì)胞可通過car識別腫瘤表面抗原，避免了tcr活化t細(xì)胞的mhc限制性。這項(xiàng)改造允許已知抗原的定位，并有助于促進(jìn)散在的t細(xì)胞群進(jìn)行再次靶向。作者的研究表明了改造的t細(xì)胞負(fù)載ov進(jìn)行聯(lián)合治療的可行性。
將人或小鼠car-t細(xì)胞負(fù)載vsv或vvdd沒有對細(xì)胞表現(xiàn)和功能造成任何影響，這表明這些病毒的負(fù)載相對無害。此外，將car-t負(fù)載ov并轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤靶標(biāo)對car識別腫瘤的能力沒有影響。這一考慮十分重要，因?yàn)槁?lián)合治療不能影響這兩種治療單獨(dú)使用時(shí)各自的效力。ov與car-t聯(lián)合可以使殺傷效果互補(bǔ)。病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并引發(fā)腫瘤炎癥使腫瘤細(xì)胞裂解，其作用是驅(qū)動內(nèi)源性抗腫瘤免疫力。在act小鼠模型中，腫瘤活化的t細(xì)胞聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)vsv有助于保持過繼性細(xì)胞的活化狀態(tài)。將ov裝載到t細(xì)胞中，可避免ov在血液系統(tǒng)中被免疫識別，并可將ov轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤。因此這些療法具有互補(bǔ)性。
car-t與ov聯(lián)用的另一個(gè)值得關(guān)注的是，許多ov包括vsv和vvdd，在溶瘤作用中可誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)血管封閉。這將阻止car-t浸潤腫瘤，從而限制了car-t的功效。使用加載了ov的car-t細(xì)胞，病毒和t細(xì)胞將在腫瘤中同時(shí)存在并有可能相互限制。為了更好地將負(fù)載了ov的car-t細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤，用輻照或*可以顯著提高過繼t細(xì)胞的浸潤。這些方法可以增強(qiáng)抗腫瘤功效并且降低了在使用ov時(shí)中和抗體的產(chǎn)生，因此有助于增強(qiáng)這種組合療法的效力。
作者的數(shù)據(jù)支持采用加載ov的car-t細(xì)胞治療不同種類的腫瘤。特別是作者的數(shù)據(jù)表明ov和car-t對腫瘤的治療效果具有不同的敏感性。car-t對a549肺癌細(xì)胞作用較弱，但t細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的vsvδm51消除這些細(xì)胞非常有效(圖6c)。her2-car-t細(xì)胞可大程度殺傷t47d細(xì)胞，但ov對其作用有限(圖6d)。然而這些病毒除了可以破壞腫瘤血管以及驅(qū)動內(nèi)源性免疫應(yīng)答的溶瘤作用之外，還可以治療對car-t不同敏感度的腫瘤。當(dāng)使用ov負(fù)載的car-t細(xì)胞處理d2f2/e2細(xì)胞時(shí)，作者觀察到使用vsv和car-t組合比單獨(dú)使用vsv和car-t的對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力顯著增強(qiáng)。這些數(shù)據(jù)被特別看好，因?yàn)槠浔砻鎜v負(fù)載的car-t細(xì)胞可以用于治療異質(zhì)性腫瘤。對car-t產(chǎn)生耐受的腫瘤細(xì)胞可以通過溶瘤作用被有效殺傷，而對單獨(dú)療法具有一般易感性的腫瘤細(xì)胞可以通過組合療法被有效殺傷。此外，這種治療沒有影響其他的抗腫瘤功能，顯示出這兩種療法可以兼容。這一組合可以防止抗原丟失變異，ov可以驅(qū)動對其他腫瘤抗原的內(nèi)源性免疫應(yīng)答，擴(kuò)展抗腫瘤效應(yīng)。來源于ov負(fù)載的car-t細(xì)胞的病毒moi效力很低，作者的數(shù)據(jù)表明預(yù)先負(fù)載腫瘤活化的t細(xì)胞可顯著增加ov轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤。因此這里提出了一個(gè)多種抗腫瘤方法聯(lián)用，與兩種治療方法組合相比其可以顯著降低ov使用劑量。
在作者的研究中，作者無法區(qū)分在單獨(dú)使用car-t基礎(chǔ)上使用vvdd負(fù)載的car-t的優(yōu)勢。作者推測相對于體外實(shí)驗(yàn)的局限性，car-t比vvdd更快地殺傷腫瘤靶標(biāo)。作者的數(shù)據(jù)表明，即使觀察不到的細(xì)胞的溶解，vvdd-gfp在所有三個(gè)腫瘤細(xì)胞系中都可很容易地復(fù)制，只是程度有所不同(圖6b)。成形的腫瘤vvdd 負(fù)載的 car-t組合被證明更加有效。這樣，病毒就能夠不通過car-t細(xì)胞感染并殺傷腫瘤細(xì)胞，并且可以靶向腫瘤血管以直接和間接方式破壞腫瘤。重要的是，vvdd的裝載并沒有影響到car-t的功能，因此可以提供很好的組合療法。
ov負(fù)載到car-t的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是ov具有編碼增強(qiáng)t細(xì)胞活力基因的*能力。car-t的活性和功能可以通過在腫瘤微環(huán)境中的ov產(chǎn)生的細(xì)胞因子如il-15或il-12來增強(qiáng)。ov可以編碼car-t細(xì)胞內(nèi)源性tcr識別的靶抗原，有助于推動t細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)?；蛘遫v可以對免疫t細(xì)胞抑制受體如ctla-4或pd-l1的sirna和 mirna進(jìn)行編碼，這些通路的阻斷在act中顯示出了很大的成功。因此，ov負(fù)載的car-t細(xì)胞組合治療存在更多的可能性。
總體而言，作者對ov負(fù)載的car-t細(xì)胞這種組合療法研究證明，這種結(jié)合可有效增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)并且可行。這為測試其他ov，以及基因修飾的ov增強(qiáng)t細(xì)胞功能奠定了基礎(chǔ)。重要的是，作者的數(shù)據(jù)為在使用組合療法時(shí)對ov和car-t相互作用的理解提供了幫助。