用 途：用于大鼠血清、血漿及相關液體樣本中羥脯氨酸(hyp)測定。
工作原理
本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法 (elisa) 測定樣品中 大鼠羥脯氨酸(hyp)水平。向預先包被了大鼠羥脯氨酸(hyp)單克隆抗體的酶標孔 中加入大鼠羥脯氨酸(hyp)，溫育；溫育后，加入生物素標記的抗 hyp 抗體。再 與鏈霉親和素-hrp 結合，形成免疫復合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結合的 酶，然后加入底物 a、b，產(chǎn)生藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色 的深淺與樣品中大鼠羥脯氨酸(hyp)的濃度呈正相關。
試劑盒組成
試劑盒組成
48 孔配置
96 孔配置
保存
說明書
1 份
1 份
封板膜
2 片 (48)
2 片 (96)
密封袋
1 個
1 個
酶標包被板
1 ×48
1 ×96
2-8℃保存
標準品 80μg/l
0.5ml×1 瓶
0.5ml×1 瓶
2-8℃保存
標準品稀釋液
3ml×1 瓶
6ml×1 瓶
2-8℃保存
鏈霉親和素-hrp
3 ml×1 瓶
6 ml×1 瓶
2-8℃保存
生物素標記的抗 hyp 抗體
0.5ml×1 瓶
1 ml×1 瓶
2-8℃保存
顯色劑 a 液
3 ml×1 瓶
6 ml×1 瓶
2-8℃保存
顯色劑 b 液
3 ml×1 瓶
6 ml×1 瓶
2-8℃保存
終止液
3ml×1 瓶
6ml×1 瓶
2-8℃保存
濃縮洗滌液
(20ml×20 倍) × 1 瓶
(20ml×30 倍) × 1 瓶
2-8℃保存
需要而未提供的試劑和器材
1． 37℃恒溫箱。
2． 標準規(guī)格酶標儀。
3． 精密移液器及一次性吸頭
4． 蒸餾水，
5． 一次性試管
6． 吸水紙
注意事項
1． 從 2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少 30 分鐘。酶標包 被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2． 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差
3． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
4． 為避免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。
5． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
6． 底物 b 對光敏感，避免長時間暴露于光下。
洗板方法
手工洗板方法：甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下 用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少 0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡 1-2 分鐘。根據(jù)需 要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中
標本要求
1．不能檢測含nan3 的樣品，因 nan3 抑制辣根過氧化物酶的 (hrp) 活性。
2．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實 驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
操作程序
1. 標準品的稀釋： (本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小
試管中進行稀釋。)
40μg/l
5 號標準品
120 μ l 的原倍標準品加入 120 μ l 標準品稀釋液
20μg/l
4 號標準品
120 μ l 的 5 號標準品加入 120 μ l 標準品稀釋液
10μg/l
3 號標準品
120 μ l 的 4 號標準品加入 120 μ l 標準品稀釋液
5μg/l
2 號標準品
120 μ l 的 3 號標準品加入 120 μ l 標準品稀釋液
2.5μg/l
1 號標準品
120 μ l 的 2 號標準品加入 120 μ l 標準品稀釋液
2. 根據(jù)代測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白 孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
3. 加樣：1) 空白孔，空白對照孔不加樣品，生物素標記的抗 hyp 抗體，鏈霉 親和素-hrp，只加顯色劑 a&b 和終止液，其余各步操作相同；2) 標準品孔： 加入標準品 50ul，鏈霉親和素-hrp50ul(標準品中已事先整合好生物素抗體， 故不加)；3) 代測樣品孔：加入樣本 40ul，然后各加入抗 hyp 抗體 10ul、 鏈霉親和素-hrp50ul，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育 60 分鐘。
4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后 棄去，如此重復 5 次，拍干。
6. 顯色：每孔先加入顯色劑a50ul，再加入顯色劑 b50 μ l，輕輕震蕩混勻，37℃ 避光顯色 15 分鐘.
7. 終止：每孔加終止液 50 μ l，終止反應 (此時藍色立轉黃色)。
8. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度 (od 值) 。 測定應 在加終止液后 10 分鐘以內(nèi)進行。
9. 根據(jù)標準品的濃度及對應的od 值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù) 樣品的od 值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟 件來計算。
操作程序總結：
1.準備試劑，樣品和標準品
2.加入準備好的樣品和標準品，生物素標記的二抗和酶標試劑，37℃反應60分鐘
3.洗板5次，加入顯色液a、b，37℃顯色15分鐘
4.加入終止液
5.10分鐘內(nèi)讀od值
6.計算
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù) r 值為 0.92 以上。
2.批內(nèi)與批間應分別小于9%和 15%
檢測范圍：
檢測范圍：0-40μg/l。
保存條件及有效期：
保存：2-8℃。
有效期：6 個月(2-8℃)。