本試劑盒僅供科研使用
α-半乳糖苷酶（α-galactosidase, α-gal）試劑盒說(shuō)明書 （貨號(hào)：ws3250f 分光法 24 樣）
一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： α-半乳糖苷酶(α-gal,ec 3.2.1.22)可特異性地水解多糖、糖脂、糖蛋白中糖鏈末端的 α-半乳糖苷鍵。在人、動(dòng)物、植物、微生物體內(nèi)均存在。在食品飼料和醫(yī)藥等領(lǐng)域中有 著廣泛的應(yīng)用前景。 本試劑盒提供一種簡(jiǎn)單，靈敏，快速的測(cè)定方法，α-gal 分解對(duì)-硝基苯-α-d-吡喃半 乳糖苷生成黃色的對(duì)-硝基*酚（pnp），后者在 405nm 有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值 升高速率來(lái)計(jì)算α-gal 活性。
二、測(cè)試盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 30ml×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前加 2ml 水。 試劑二 液體 8ml×1 瓶 4℃保存 試劑三 液 20ml×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。
三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計(jì)、1ml 玻璃比色皿（光徑 1cm）、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、 研缽、冰。
四、α-半乳糖苷酶（α-gal）活性檢測(cè)： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1ml 提取液，冰浴 勻漿，然后 12000rpm，4℃，離心 10min，取上清作為粗體液，置于冰上待測(cè)。
【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌或細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì) 胞，加入 1ml 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200w，超聲 3s， 間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000 rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積（ml)為 500~1000:1 比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 可見分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，溫度設(shè)定 37℃，波長(zhǎng)設(shè)定為 405nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 在 ep 管中依次加入： 試劑名稱（μl） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 20 20 試劑一 75 蒸餾水 75 試劑二 115 115 迅速混勻，37℃保溫 30min本試劑盒僅供科研使用 2 試劑三 540 540 混勻，全部液體轉(zhuǎn)移到 1ml 玻璃比色皿（光徑 1cm）中，405nm 處測(cè)定吸光值 a，δa=a 測(cè)定-a 對(duì)照（每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè) 對(duì)照管）。
【注】：若δa 過(guò)小，可增加樣本上樣量 v1（如增至 60μl，則試劑三相應(yīng)減少），或延長(zhǎng)保 溫時(shí)間（如：40min 或更長(zhǎng)），則改變后的 v1 或 t 需重新代入計(jì)算公式計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.022x + 0.0045：x 是標(biāo)準(zhǔn)品 pnp 的質(zhì)量（nmol），y 是δa。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚(pnp)定義為一個(gè)酶活性單位。 α-gal 活性(nmol/min/mg prot)=[(δa-0.0045)÷0.022]÷(v1×cpr)÷t=75.76×(δa-0.0045)÷cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚(pnp)定義為一個(gè)酶活性單位。 α-gal 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(δa-0.0045)÷0.022]÷(w×v1÷v)÷t=75.76×(δa-0.0045)÷w 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚定義為一個(gè)酶活性單位。 α-gal 活性(nmol/min/104cell)=[(δa-0.0045)÷0.022]÷(500×v1÷v)÷t=0.152×(δa-0.0045) 5、按液體體積： 單位定義：每毫升液體每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚(pnp)定義為一個(gè)酶活性單位。 α-gal 活性(nmol/min/ml)=[(δa-0.0045)÷0.022]÷v1÷t=75.76×(δa-0.0045) v---加入提取液體積，1ml； v1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01ml； w---樣本質(zhì)量，g； t---反應(yīng)時(shí)間，30min； pnp 對(duì)分子質(zhì)量---139.11； 500---細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量，萬(wàn)； cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml，建議使用本公司的 bca 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/ml）：向標(biāo)準(zhǔn)品 ep 管里面加入 1ml 蒸餾水。 2 把母液用蒸餾水稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3mg/ml。也 可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 在 ep 管加入：20μl 標(biāo)準(zhǔn)品+75μl 蒸餾水+115μl 試劑二+540μl 試劑三，混勻，全 部液體轉(zhuǎn)移到 1ml 玻璃比色皿中，于 405nm 下讀取吸光值。 4 根據(jù)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
關(guān)鍵詞：分光光度計(jì) 臺(tái)式離心機(jī) 水浴鍋 移液器 濃度計(jì)