主要用途
細胞培養(yǎng)液氧化應(yīng)激活性氧（ros）光澤精化學發(fā)光法定量檢測試劑是一種旨在通過使用自由基探針光澤精， 捕獲細胞培養(yǎng)上清液中的活性氧族， 使發(fā)光物氧化降解并發(fā)光， 在化學發(fā)光儀（luminometer）的幫助下定量檢測細胞培養(yǎng)液活性氧族（超氧自由基陰離子） 的生成和數(shù)量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。適用于各種動物和人體細胞培養(yǎng)液的活性氧族的檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定，檢測敏感。
技術(shù)背景
超氧自由基陰離子（superoxide radical；o2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；h2o2）、羥自由基或氫氧基 （hydroxyl radical；oh-）、過氧化基（peroxyl radical；roo-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；hoo）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric oxide；no-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；onoo-）次氯酸（hypochlorous acid；hocl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內(nèi)活性氧族（reactive oxygen species；ros）的產(chǎn)生和增多，甚而導致諸如男性不育、冠心病、風濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。光澤精（lucigenin），又稱硝酸雙-n-甲基吖啶翁
（bis-n-methylacridinium nitrate），是一種帶正電荷的發(fā)光劑，單價還原后生成光澤精自由基，再與超氧自由基陰離子反應(yīng)生成不穩(wěn)定的中間物光澤精二惡二酮，由此分解成電激發(fā)狀態(tài)（n－甲基丫啶酮），通過釋放光子，回復到基態(tài)。光澤精作為探針，可以特異性檢測細胞培養(yǎng)系統(tǒng)超氧自由基陰離子，其發(fā)光強度與超氧自由基陰離子水平成正相關(guān)。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（reagent a）
發(fā)光液（reagent b）
產(chǎn)品說明書
保存方式
毫升
毫升
1份
保存發(fā)光液（reagent b） 在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保
證6月
用戶自備
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
臺式離心機：用于去除樣品雜質(zhì)
測試管：用于發(fā)光檢測用的專用試管
化學發(fā)光儀：用于檢測化學發(fā)光
實驗步驟
一、樣品預(yù)處理
1． 準備1 瓶25cm2細胞培養(yǎng)瓶的新鮮待測細胞
2． 小心移取細胞培養(yǎng)液到15 毫升錐形離心管
3． 放進4℃臺式離心機離心10 分鐘，速度為300g
4． 小心移取上清液到新的15 毫升錐形離心管
5． 根據(jù)上清液容量和細胞數(shù)，計算出（n） x106細胞/毫升
6． 放進37℃培養(yǎng)箱里備用（1小時內(nèi)）
二、測讀
測讀開始前，打開化學發(fā)光儀，設(shè)定儀器內(nèi)溫度為37℃預(yù)熱和整合測讀10秒或15分鐘； 然后關(guān)掉實驗室的燈光。將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化，嚴格置于暗室里。然后進行下列操作。
1． 準備好測試管，做好標記：陰性對照、樣品本底和樣品活性
2． 移取xx 微升清理液（reagenta）到陰性對照測試管
3． 移取400 微升上述預(yù)處理的細胞培養(yǎng)液到樣品本底測試管
4． 移取400 微升上述預(yù)處理的細胞培養(yǎng)液到樣品活性測試管
5． 分別加入xx 微升發(fā)光液（reagent b）到上述測試管，除樣品本底測試管
6． 輕輕渦旋混勻
7．即刻放進37℃化學發(fā)光儀里測讀
8．整合測讀10秒，獲得相對發(fā)光單位（relative light unit；rlu）
9．或者整合測讀15分鐘， 獲得光電子讀數(shù)：x106cpm（counted photon per minute）（注意： 可以使用液體閃爍儀替代）
10．計算ros 水平：
（樣品活性－樣品本底） ÷ 細胞】＝x106cpm/毫升＝x106cpm/【（n）x106 細胞】
注意事項
1． 本產(chǎn)品為50次操作
2． 如果測定體系變化，則試劑用量相應(yīng)變化
3． 操作時，須戴手套
4． 測試前，細胞培養(yǎng)液須新鮮收集，1小時內(nèi)為最佳
5． 樣品制備后即刻測讀，不宜過夜保存
6． 培養(yǎng)液上清須澄清
7． 必要時，例如活性氧族過低，可以濃縮樣品處理
8． 測讀的所有步驟均須在暗室里進行
9． 如果是注射式化學發(fā)光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗化學發(fā)光儀注射（injector）管道10．本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感