研究亮點：
1 系統(tǒng)性方法揭示了gata4在人類心臟發(fā)育和功能中的作用
2 雜合子gata4錯義突變損害心臟基因程序
3 gata4 g296s突變破壞了心臟增強子tbx5的基因組占用
4 pi3k信號通路是gata4基因調控網(wǎng)絡的關鍵樞紐
研究背景
轉錄因子(tfs)之間的組合相互作用導致組織特異性基因表達，從而決定了細胞的特性并維持細胞內穩(wěn)態(tài)平。tfs通過招募其他tfs、輔激活因子或輔抑制因子來激活或抑制基因轉錄。超級增強子(ses)，被中介復合物和tfs密集占據(jù)的假定增強子簇，被認為是發(fā)育和疾病中細胞同一性的調節(jié)因子。ses的失調可能導致人類胚胎發(fā)生發(fā)育障礙和產(chǎn)后疾病。發(fā)育畸形占人類出生率大于5%。其中，先天性心臟缺損所占比例maximum（0.8%），而且通常是由于發(fā)育性調節(jié)型心臟tfs單倍型不足而導致的。在tfs中雜合突變gata4和tbx5會導致家族性先天性心臟發(fā)育不全，二者表型重疊；當過表達這兩個基因時，兩者免疫共定位。在零星的先天性心臟發(fā)育不全中，這兩個基因存在突變，且與心肌病相關。我們之前的研究表明，gata4在g296s位點的突變會導致gata4和tbx5在體外的互作能力受損。攜帶復合雜合子gata4和tbx5突變的小鼠會發(fā)生房室間隔缺損，為gata4與tbx5二者之間的互作提供了遺傳學證據(jù)。
盡管gata4和tbx5對小鼠心臟發(fā)生至關重要，但它們在人類心肌細胞（cms）中共同調節(jié)的基因靶點或信號通路以及它們如何調節(jié)人類心臟間隔的形成尚不清楚。與gata4相互作用的tbx5或nkx2.5*缺失，表明這些tfs在小鼠心臟分化中相互依賴調節(jié)彼此的基因組占用。
研究結果
轉錄因子中高度保守殘基的突變可能會影響蛋白與蛋白或蛋白間的相互作用，導致基因網(wǎng)絡的失調和人類疾病。本研究使用患者源性誘導多能干細胞(ips)細胞來剖析gata4在人類心臟發(fā)育和功能中的調節(jié)機制。研究人員利用了來自于患者g296s突變的、通過crispr-cas9修正的(iwt) 以及正常人的野生型（wt）成纖維細胞以非整合游離載體方法重編程獲得三種ips，在圖案化水凝膠的作用下將ips培養(yǎng)分化為心肌細胞cms。在分化cms過程中，對其進行轉錄組測序及分析，對心肌細胞分化過程中的標志性基因表達情況，鈣通量及顯微鏡下形態(tài)進行了檢測和分析。
研究發(fā)現(xiàn)，雜合的gata4 g296s突變損害了心臟基因程序和sonic hedgehog (shh)信號通路的表達，同時上調了可變命運基因的表達，特別是內皮細胞譜系和與心臟分隔相關的基因。在與心臟發(fā)育和肌肉收縮相關的基因se元件處，gata4依賴的tbx5的募集被中斷，而在參與內皮分化的基因座染色質關閉失敗。這項工作揭示了一個關鍵心臟tf的單一錯義突變是如何通過劑量依賴性調節(jié)tf復合物向增強因子的招募而導致疾病的，并揭示了治療干預的潛在節(jié)點。
圖1 g296s cms心臟功能受損。（a）流式分析來源于wt和g296s分化而來的、乳酸純化后的c替恩替+cms 。（b）cms的單細胞陣列的微圖(上)和α-actinin或f-actin的免疫染色(下)。（c）微觀模式的收縮測量。wt和g296s單厘米對1 hz起搏響應的百分比（左圖）。牽引力顯微鏡測量力產(chǎn)生作為細胞運動的cms對1hz起搏響應的函數(shù)(右圖)。（d） wt和g296s cms的動作電位測量。（e）微團簇上鈣通量的測量。（f）特定微組織的鈣通量測量。（g）α-actinin染色觀察單個肉瘤類cms所占的百分比。（h）線粒體單厘米微模式染色強度(上圖)。定量測量細胞核分裂追蹤器相對于細胞面積的紅色強度(下圖)。（i）糖酵解功能測量。
圖2 gata4 - tbx5 grn顯示樞紐集中于pi3k信號。（a）gata4控制的grn（b）按基因符號命名的前20個樞紐的子網(wǎng)絡圖（c）在pi3k信號被抑制(圓形)或激活(三角形)后iwt(黑色)和g296s(紅色)cms產(chǎn)生的相對變化（d）pi3k信號被抑制(圓形)或激活(三角形)后，iwt(黑色)和g296s(紅色)cms的搏動率測量（e）假設模型。上圖，wt基因的心臟基因位點開放且允許g4t5與med1結合的se元件結合，激活轉錄;g4t5和hdac2抑制異常內皮基因轉錄。下圖，gata4 g296s的轉錄和表觀遺傳結果。心臟基因座降低了開放染色質和tbx5與se元素的結合，降低了轉錄;異常開放的染色質缺失了gata4-hdac2，但tbx5富集，同時ets因子的基序導致內皮基因轉錄沉默失敗，其他參與間隔發(fā)育的位點未描述。
研究意義
本研究表明，適當?shù)男呐K發(fā)育和功能需要med1結合的h3k27ac標記se元素的gata4-tbx5的共同參與，以維持開放的染色質狀態(tài)并激活心源性基因轉錄。雜合性gata4錯義突變影響蛋白質-蛋白質相互作用，tbx5無法募集到se元件與未能保持開放的染色質狀態(tài)以及心臟基因的轉錄降低有關。gata4 g296s突變允許tbx5和其他轉錄激活因子的錯誤定位，導致無法招募到hdac2，并在內皮啟動子上實現(xiàn)更封閉的染色質特征。結果導致內皮基因表達的異常激活和譜系改變。參與shh信號接收和心臟分離的基因失調為gata4 g296s患者的三維間隔缺損提供了分子基礎。這些研究揭示了tf復合物如何通過協(xié)同調控反式作用因子的全基因組定位來控制基因表達的激活和抑制，以及當協(xié)同性被破壞時疾病是如何發(fā)生的。
這一研究結果解釋了一個啟動人類心臟基因程序的組合tf結合密碼子，并揭示了通過錯義突變破壞該密碼子如何導致表觀遺傳和轉錄失調和人類疾病。atac-seq分析開放染色質特征和gata4和tbx5結合位點的全基因組分析提供了人類tf結合增強子的詳細目錄，并補充了稀缺心臟細胞類型的編碼數(shù)據(jù)，同時利用這些數(shù)據(jù)鑒定了一個假定的g4t5輔抑制子。綜上所述，本研究揭示了一個組合的tf代碼，這一代碼確保了一個強大的心臟基因程序，闡明了當通過干擾該代碼的tf協(xié)同性時人類疾病是如何發(fā)生的，并提出了治療干預的潛在節(jié)點。
本實驗中特別涉及了一種細胞培養(yǎng)和測量手段
ips-cms細胞的體外培養(yǎng)
將細胞接種在聚丙烯酰胺水凝膠裝置上，該裝置具有基質凝膠微結構。由縮印手段在水凝膠表面制備長寬比為7:1、面積為2000平方微米的矩形凹槽。這些特定的微結構具備一定的剛度及形狀，有利于模擬體內cms的真實環(huán)境，可原位培養(yǎng)并分析單個cms。之后，可用牽引力顯微鏡計算細胞附著在聚丙烯酰胺表面所產(chǎn)生的力。
單個cms收縮力測量
在水凝膠中混入熒光微珠，使用zeiss倒置顯微鏡測試收縮cms的明場視頻以及因細胞收縮而移動的綠色熒光微珠的視頻。明場視頻被用來計算每個收縮周期的細胞運動及平均位移。熒光微珠視頻則提交到牽引力顯微鏡算法來計算收縮力。
鈣通量分析，膜片鉗測試
fluo-4染色后采用延時成像技術來測量鈣通量。選擇自發(fā)收縮的微團簇的特定區(qū)域，用軟件量化動作電位之間測量到的鈣瞬變表達相對于基線熒光的峰值振幅。采用全細胞膜片鉗在單細胞水平測量cms的動作電位
作為實驗前置內容，細胞培養(yǎng)與力學、鈣通量測試在后續(xù)基因表達分析工作中起到了關鍵性的作用。在該工作中使用的是英國plexithermo的hcells高通量單細胞、器官功能測量及納米水凝膠3d培養(yǎng)系統(tǒng)。
該系統(tǒng)可使用多種定制水凝膠耗材模擬細胞微環(huán)境，亦可以自行設計蝕刻水凝膠以滿足不同的研究需求，尤其適用于心肌細胞體外培養(yǎng)環(huán)境的構建。搭配unique的細胞追蹤技術，可短時間內測量300個以上細胞的收縮及離子濃度變化情況。搭配多孔位細胞培養(yǎng)板，實現(xiàn)真正的高通量細胞測試，每個孔位即可作為一組對照實驗，不同孔位同時培養(yǎng)，同時測量，極大節(jié)省時間及耗材。
適用范圍：
1、心肌細胞
采用超速成像納米水凝膠技術，可wanmei模擬器官硬度。批量測心肌細胞的力學指標和離子濃度變化。包括細胞收縮速度和力度、收縮功率，收縮角度，速度差和力差等，
2、細胞遷移和精子運動軌跡
跟蹤檢測細胞軌跡，并可計算定量數(shù)據(jù)，如：運動軌跡，距離和速度。
3、動態(tài)跟蹤細胞增殖的情況，如菌落形成。
4、人ips細胞衍生神經(jīng)細胞的細胞活力測定：神經(jīng)元運動的功率譜密度（psd）可，用于準確預測細胞死亡。psd表示一個單元在頻域中的運動強度，能夠更精確地預測細胞死亡。
5、核跟蹤特征可用于分析癌細胞遷移
6、測量對象：癌細胞、斑馬魚、精子、菌落、貼壁細胞（如：急性分離的成年小鼠細胞，乳鼠細胞、成年大鼠的心肌細胞、骨骼肌細胞等）。
參考文獻：
ang y s , rivas r n , ribeiro a j s , et al. disease model of gata4 mutation reveals transcription factor cooperativity in human cardiogenesis[j]. cell, 2016, 167(7):1734-1749.e22.