2.3.1急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)
2.3.1.1目的
(1)檢測(cè)**劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的急性毒性作用和強(qiáng)度。
(2)為亞急(慢)性毒性等試驗(yàn)提供劑量選擇的依據(jù)。
2.3.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
小鼠或大鼠任選一種,雌雄各半。小鼠體重18g~22g,大鼠體重180g~220g,根據(jù)不同的計(jì)算ld50方法,選用適當(dāng)?shù)膭?dòng)物數(shù)量。
2.3.1.3試驗(yàn)分組
如應(yīng)用概率單位-對(duì)數(shù)圖解法計(jì)算ld50,隨機(jī)分為5個(gè)~6個(gè)劑量組。通常*高劑量組的動(dòng)物死亡率應(yīng)≥90%,*低劑量組動(dòng)物死亡率應(yīng)≤10%??上纫暂^大的組距較少量動(dòng)物進(jìn)行預(yù)試,找出其粗略致死劑量范圍,然后再設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量分組。
2.3.1.4操作程序
(1)動(dòng)物的準(zhǔn)備:試驗(yàn)前,一般禁食過(guò)夜,不限制飲水。
(2)受試物的配制:常以水或食用植物油為溶劑配制成溶液,或采用0.5%羧甲基纖維素配制成混懸液。灌胃給予受試物的*大容量,小鼠不超過(guò)0.2ml/10g體重,大鼠不超過(guò)1.0ml/100g體重。
(3)染毒方法:用灌胃方式將受試物一次給予動(dòng)物。若受試物毒性很低,一次灌胃容量太大,可在24h內(nèi)分成2次~3次給予,其總劑量作為一日劑量計(jì)算。
(4)染毒后觀察動(dòng)物的中毒表現(xiàn)和死亡數(shù)及死亡時(shí)間,并對(duì)死亡動(dòng)物和觀察期滿處死動(dòng)物進(jìn)行尸體解剖,肉眼觀察,發(fā)現(xiàn)有異常的組織或臟器,尚需進(jìn)一步作組織病理學(xué)檢查。觀察時(shí)間14d。
2.3.1.5ld50的計(jì)算方法
根據(jù)給受試物后14d內(nèi)的各劑量組動(dòng)物死亡率計(jì)算ld50半數(shù)致死劑量)。(
2.3.1.5.1概率單位-對(duì)數(shù)圖解法:
(1)根據(jù)各劑量組動(dòng)物死亡率,從表2-9 中查各組的概率單位。因死亡率為 0% 和100%的概率單位,與所試動(dòng)物數(shù)有關(guān),故需另在表2-10中查找。
例如:對(duì)死亡率為45%的概率單位,可查表2-9。先在表的左側(cè)縱標(biāo)目上找到40,而后在表的上行橫標(biāo)目處找到5,兩者交叉點(diǎn)處的4.87,即為45% 的概率單位。
又如:某組用 10只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,如果全部存活(死亡率為0%),查表2-10,其概率單位為 3.04。
表2-9百分率-概率單位換算表
%0 123 456789
0.. 2.672.953.123.253.363.45 3.523.593.66
103.723.773.823.873.923.964.014.05 4.084.12
204.164.194.234.264.294.334.364.394.424.45
30 4.484.504.534.564.594.614.644.674.694.72
40 4.754.774.804.824.854.874.904.924.954.97
50 5.005.035.055.085.105.135.155.185.205.23
60 5.252.285.315.335.365.395.415.445.475.50
70 5.525.555.585.615.645.675.715.745.775.81
80 5.845.885.925.955.996.046.086.136.186.23
906.286.346.416.486.556.646.756.887.057.33
注: 橫標(biāo)目數(shù)字為死亡率的個(gè)位數(shù),縱標(biāo)目數(shù)字為死亡率的十位數(shù)。
表2-10 相應(yīng)于反應(yīng)率為 0%及100%的概率單位
該組動(dòng)物數(shù) 反應(yīng)率該組動(dòng)物數(shù)反應(yīng)率
0%100%0%100%
...... ... 113.007.00
23.85 6.1512 2.97 7.03
33.62 6.38132.93 7.07
4 3.47 6.53 14 2.907.10
5 3.36 6.64 152.877.13
6 3.27 6.73 16 2.85 7.15
7 3.20 6.80 172.82 7.18
8 3.13 6.87 18 2.80 7.20
93.09 6.91 19 2.78 7.22
103.046.96202.767.24
(2)用方格紙繪散點(diǎn)圖,橫軸表示劑量的對(duì)數(shù)值(x),縱軸為概率單位值(y),將各組數(shù)值點(diǎn)在圖上。
(3)按各點(diǎn)的分布趨勢(shì),用直尺繪出一條*適合于各點(diǎn)的直線,使線上方的點(diǎn)到線的總距離與線下方的點(diǎn)到線的總距離相近,此線應(yīng)盡量靠近概率單位為 5的點(diǎn)及附近的點(diǎn)。
(4) 查出求概率單位 5 處的劑量對(duì)數(shù),其反對(duì)數(shù)即為ld50。
按下列公式計(jì)算 ld50的 95%可信限。
s =(x2-x1-y1))/(y2
sm=s/(n'/2)-1/2
ld50對(duì)數(shù)值的95%可信限 = logld50±1.96sm
(上式結(jié)果,經(jīng)反對(duì)數(shù)變換后,可得ld50的95%可信限)
[sm為 ld50的標(biāo)準(zhǔn)誤;s為標(biāo)準(zhǔn)差;x1、x2分別為機(jī)率單位等于4(y1和6(y2時(shí)相應(yīng)的劑量對(duì)數(shù)值;n'為y1及y2相應(yīng)的死亡率間所用的動(dòng)物數(shù)]。(=6)(=4)))
2.3.1.5.2一次*大限度試驗(yàn):
如20只動(dòng)物(雌雄各半)一次灌胃劑量5000mg/kg體重,在14d內(nèi)又無(wú)死亡,可判定ld50大于5000mg/kg體重。
2.3.1.5.3其他方法:如霍恩(horn)法、寇氏(karber)法等。
2.3.1.6 評(píng)價(jià)規(guī)定
**劑的毒性評(píng)價(jià):
ld50大于5000mg/kg體重者屬實(shí)際無(wú)毒;
ld50為501mg/kg~5000mg/kg體重者屬低毒;
ld50為51mg/kg~500mg/kg體重者屬中等毒;
ld50為1mg/kg~50mg/kg體重者屬高毒;
ld50小于1mg/kg體重者屬劇毒。
注:為評(píng)價(jià)**劑在實(shí)際應(yīng)用時(shí)對(duì)人體的安全性,當(dāng)產(chǎn)品原形ld50≤5000mg/kg體重時(shí),需增做**劑*高應(yīng)用液濃度5倍溶液的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn),并計(jì)算其ld50。
2.3.2急性吸入毒性試驗(yàn)
2.3.2.1 目的
檢測(cè)**劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的急性吸入毒性作用和強(qiáng)度。
2.3.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
小鼠或大鼠任選一種,雌雄各半。小鼠體重為18g~22g,大鼠體重為180g~200g。
2.3.2.3 操作程序
染毒可采用靜式染毒法或動(dòng)式染毒法。
2.3.2.3.1 靜式染毒法
靜式染毒是將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放在一定體積的密閉容器(染毒柜)內(nèi),加入一定量的**劑,并使其揮發(fā),造成實(shí)驗(yàn)需要**劑濃度的空氣,一次吸入性染毒2h。
(1)染毒柜的容積以每只染毒小鼠每小時(shí)不少于3l空氣計(jì),每只大鼠不少于30l計(jì)。
(2)染毒濃度的計(jì)算:染毒濃度一般應(yīng)采用實(shí)際測(cè)定濃度。在染毒期間一般可測(cè)4次~5次,求其平均濃度。在無(wú)適當(dāng)測(cè)試方法時(shí)??捎孟率接?jì)算染毒濃度
a×d
c= ×106
v
式中:c— 染毒濃度(mg/m3)
a— 加入**劑量(ml)
d— **劑比重
v— 染毒柜容積(l)
2.3.2.3.2 動(dòng)式染毒法
動(dòng)式染毒是采用機(jī)械通風(fēng)裝置,連續(xù)不斷地將含有一定濃度**劑的空氣均勻不斷地送入染毒柜,并排出等量的染毒氣體,維持相對(duì)穩(wěn)定的染毒濃度。一次吸入性染毒2h。
(1)**劑氣化(霧化)和輸入的常用方法
1)氣體**劑,經(jīng)流量計(jì)與空氣混合成一定濃度后,直接輸入染毒柜。
2)易揮發(fā)液體**劑,通過(guò)空氣鼓泡或適當(dāng)加熱促使揮發(fā)后輸入染毒柜。
3)若**劑現(xiàn)場(chǎng)使用采取噴霧法時(shí),可采用噴霧器或*使其霧化后輸入染毒柜。
(2)染毒濃度計(jì)算染毒濃度一般應(yīng)采用動(dòng)物呼吸帶實(shí)際測(cè)定濃度,每半小時(shí)一次,取其平均值。若無(wú)適當(dāng)?shù)臏y(cè)試方法,也可采用以下公式計(jì)算染毒濃度:
a×d
c= ×106
v1+ v2
式中:c—染毒濃度(mg/m3)
a—?dú)饣蜢F化**劑量(ml)
d— **劑比重
v1— 輸入染毒柜風(fēng)量(l)
v2— 染毒柜容積(l)
2.3.2.3.3觀察和記錄染毒過(guò)程和觀察期內(nèi)的動(dòng)物癥狀和死亡情況。關(guān)于染毒濃度的設(shè)計(jì)、動(dòng)物分組、觀察期限、觀察指標(biāo)和lc50(半數(shù)致死濃度)的計(jì)算等可參照急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)(2.3.1)。
在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,如20只動(dòng)物(雌雄各半)一次2h吸入染毒濃度10000mg/m3,在14d內(nèi)無(wú)死亡,可判定lc50大于10000mg/m3。
2.3.2.4評(píng)價(jià)規(guī)定
**劑的毒性評(píng)價(jià):
lc502h大于10000mg/m3 者屬實(shí)際無(wú)毒;
lc502h為1001mg/m3~10000mg/m3 者屬低毒;
lc502h為101mg/m3~1000mg/m3 者屬中等毒;
lc502h為10mg/m3~100mg/m3 者屬高毒;
lc50小于10mg/m3者屬劇毒。2h
2.3.3皮膚刺激試驗(yàn)
2.3.3.1目的
檢測(cè)**劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚的刺激/腐蝕作用和強(qiáng)度。
2.3.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
每次試驗(yàn)*少需 3 只皮膚完好的健康家兔或豚鼠。
2.3.3.3 操作程序
2.3.3.3.1一次完整皮膚刺激試驗(yàn)
(1)在試驗(yàn)前24h,用脫毛劑將家兔或豚鼠背部脊柱兩側(cè)的毛去掉,不得損傷皮膚。去毛范圍,左、右各約3cm×3cm。
(2)次日將受試物(濃度一般為皮膚**應(yīng)用液的5倍或原液0.5ml(g)直接滴于面積為2.5cm×2.5cm的一側(cè)去毛完整皮膚上,或滴于同樣大小的2層~4層紗布上并敷貼在一側(cè)去毛皮膚表面,然后用一層無(wú)刺激塑料膜或油紙覆蓋,再用無(wú)刺激膠布固定。另一側(cè)去毛皮膚作為空白對(duì)照(或溶劑對(duì)照)。敷貼時(shí)間為4h。試驗(yàn)結(jié)束后,用溫水或無(wú)刺激性溶劑除去殘留受試物。
(3)分別于去除受試物后1h、24h和48h觀察皮膚局部反應(yīng),并按表2-11進(jìn)行刺激反應(yīng)評(píng)分。
2.3.3.3.2 一次破損皮膚刺激試驗(yàn)
(1)涂受試物前,在2.5cm×2.5cm的去毛皮膚上,用75%酒精清潔、**暴露皮
膚,待酒精揮發(fā)后,用**刀片或注射針頭在皮區(qū)內(nèi)劃一個(gè)“井”形的破損傷口,并在該破損皮區(qū)內(nèi)染毒。注意皮膚破損僅達(dá)表皮,不要傷及真皮。
(2)手術(shù)前的皮膚準(zhǔn)備,手術(shù)后受試物涂抹和局部皮膚反應(yīng)的觀察,評(píng)分方法同
2.3.3.3.1。注意鑒別感染和原發(fā)性刺激反應(yīng)的區(qū)別,若有感染可疑,應(yīng)進(jìn)行重復(fù)測(cè)試。
2.3.3.3.3多次完整皮膚刺激試驗(yàn)
(1)試驗(yàn)前動(dòng)物皮膚準(zhǔn)備同2.3.3.3.1 (1)。
(2)次日將受試物[濃度同2.3.3.3.1(2)]0.5ml(g)涂在一側(cè)皮膚上,另一側(cè)涂溶劑作為對(duì)照,在涂抹后4h,用水或無(wú)刺激的適宜溶劑清洗,除去殘留物。每天涂抹一次,連續(xù)涂抹14d。在每次涂抹后24h觀察結(jié)果,按表2-11評(píng)分。為了便于受試物的涂抹和結(jié)果觀察,必要時(shí)應(yīng)剪毛。對(duì)照區(qū)的處理方法同試驗(yàn)區(qū)。
2.3.3.4 評(píng)價(jià)規(guī)定
2.3.3.4.1一次皮膚刺激試驗(yàn)
在各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn),按照表2-11對(duì)動(dòng)物的皮膚紅斑與水腫形成情況進(jìn)行評(píng)分,并分別按時(shí)間點(diǎn)將3只動(dòng)物的評(píng)分相加,除以動(dòng)物數(shù),獲得不同時(shí)間點(diǎn)的皮膚刺激反應(yīng)積分均值(刺激指數(shù))。取其中*高皮膚刺激指數(shù),按表2-12評(píng)定該受試物對(duì)動(dòng)物皮膚刺激強(qiáng)度的級(jí)別。
2.3.3.4.2多次皮膚刺激試驗(yàn)
按下列公式計(jì)算每天每只動(dòng)物平均積分(刺激指數(shù)),并以表2-12判定皮膚刺激強(qiáng)度。
∑(每只動(dòng)物14d的紅斑和水腫總積分)
每天每只動(dòng)物平均積分=
受試動(dòng)物數(shù)×14
表2-11 皮膚刺激反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
皮膚刺激反應(yīng)皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分
紅斑形成:
無(wú)0
勉強(qiáng)可見(jiàn) 1
明顯 2
嚴(yán)重 3
紫紅色紅斑,并有焦痂 4
水腫形成:
無(wú) 0
勉強(qiáng)可見(jiàn) 1
皮膚隆起,輪廓清楚 2
水腫隆起約1mm 3
水腫隆起超過(guò)1mm4
表2-12 皮膚刺激強(qiáng)度分級(jí)
皮膚刺激指數(shù) 刺激強(qiáng)度級(jí)別
0~<0.5無(wú)刺激性
0.5~<2.0 輕刺激性
2.0~<6.0中等刺激性
6.0~8.0強(qiáng)刺激性
2.3.4急性眼刺激試驗(yàn)
2.3.4.1目的
檢測(cè)**劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼睛的急性刺激和腐蝕作用。
2.3.4.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
使用3只家兔。試驗(yàn)前檢查家兔雙眼,有異常者不能用于試驗(yàn)。
2.3.4.3操作程序
(1)受試物一般為黏膜**或空氣**應(yīng)用液的5倍濃度的溶液或原液。吸取受試物0.1ml,滴入家兔一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)。另一側(cè)眼以生理鹽水作為正常對(duì)照。
(2)滴受試物后,將眼被動(dòng)閉合4s,30s后用生理鹽水沖洗。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d,肉眼觀察家兔眼結(jié)膜、虹膜和角膜的損傷與恢復(fù)情況。如果72h內(nèi)未出現(xiàn)刺激反應(yīng),或第7d或第14d,眼睛刺激反應(yīng)*恢復(fù),即可提前終止試驗(yàn)。必要時(shí),用2% *溶液或*、放大鏡檢查角膜及虹膜變化。
2.3.4.4評(píng)價(jià)規(guī)定
按表2-13對(duì)家兔眼角膜、虹膜和結(jié)膜的急性刺激反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分,并分別計(jì)算每只動(dòng)物在三個(gè)不同觀察時(shí)間(24h、48h和72h)角膜損害、虹膜損害、結(jié)膜充血和結(jié)膜水腫四方面的“平均評(píng)分”(即每只動(dòng)物的24h、48h和72h評(píng)分之和除以觀察數(shù)3)。分別以動(dòng)物眼角膜、虹膜和結(jié)膜充血、水腫的平均評(píng)分和恢復(fù)時(shí)間進(jìn)行,按表2-14、表2-15眼刺激反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定受試物對(duì)眼睛的刺激強(qiáng)度。
表2-13家兔急性眼刺激反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
眼損害表現(xiàn)評(píng)分
角膜損害:
無(wú)潰瘍形成或混濁 0
散在或彌漫性混濁,虹膜清晰可見(jiàn) 1
半透明區(qū)易分辨,虹膜模糊不清 2
出現(xiàn)灰白色半透明區(qū),虹膜細(xì)節(jié)不清,瞳孔大小勉強(qiáng)可見(jiàn) 3
角膜不透明,混濁,虹膜無(wú)法辨認(rèn) 4
虹膜損害:
正常0
皺褶明顯加深,充血,腫脹,角膜周圍有中度充血,
瞳孔對(duì)光仍有反應(yīng) 1
出血、肉眼可見(jiàn)破壞,或瞳孔對(duì)光無(wú)反應(yīng) 2
結(jié)膜(瞼結(jié)膜、球結(jié)膜)充血
血管正常 0
血管充血呈鮮紅色 1
血管充血呈深紅色,血管不易分辨 2
彌漫性充血呈紫紅色 3
結(jié)膜(瞼結(jié)膜、球結(jié)膜)水腫
無(wú)水腫 0
輕微水腫(包括瞬膜) 1
明顯水腫,伴有部分眼瞼外翻 2
水腫*眼瞼近半閉合 3
水腫*眼瞼大半閉合 4
表2-14眼刺激性反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
可
逆
性
損
傷
無(wú)刺激性
3只動(dòng)物的平均評(píng)分:角膜損害<1、虹膜損害<1、結(jié)膜充血<2和結(jié)膜水腫<2或3只動(dòng)物中*少有2只動(dòng)物的平均評(píng)分符合上述標(biāo)準(zhǔn)。另外1只動(dòng)物的刺激反應(yīng)在21d內(nèi)*恢復(fù)。
輕刺激性
3只動(dòng)物中有2只動(dòng)物的平均評(píng)分:角膜損害≥1;虹膜損害≥1;結(jié)膜充血≥2;結(jié)膜水腫≥2,且7d內(nèi)全部動(dòng)物的刺激反應(yīng)*恢復(fù)。
刺激性**
3只動(dòng)物中有2只動(dòng)物的平均評(píng)分:角膜損害≥1;虹膜損害≥1;結(jié)膜充血≥2;結(jié)膜水腫≥2,且21d內(nèi)全部動(dòng)物的刺激反應(yīng)*恢復(fù)。
不可逆性損傷
腐蝕性***
*少有1只動(dòng)物的角膜、虹膜或結(jié)膜的刺激反應(yīng)在21d的觀察期內(nèi)未*恢復(fù)或/和在3只動(dòng)物中有2只動(dòng)物的平均評(píng)分:角膜損害≥3;虹膜損害≥1.5。
注:*恢復(fù)是指動(dòng)物的眼刺激反應(yīng)評(píng)分:角膜損害=0,虹膜損害=0,結(jié)膜充血=0或1,
結(jié)膜水腫=0或1。
**刺激性:接觸受試物后所產(chǎn)生的可逆性炎性反應(yīng)。
*** 腐蝕性:接觸受試物后所產(chǎn)生的不可逆性組織損傷。
表2-15 眼刺激性反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
平均評(píng)分
動(dòng)物數(shù)(只)
恢復(fù)時(shí)間(d)*
損傷類型
角膜損害<1和
虹膜損害<1和
結(jié)膜充血<2和
結(jié)膜水腫<2
≥2
≤21
無(wú)刺激性
角膜損害≥1或
虹膜損害≥1或
結(jié)膜充血≥2或
結(jié)膜水腫≥2
≥2
≤7
輕刺激性
≤21
刺激性
角膜損害≥3或
虹膜損害≥1.5
≥2
腐蝕性**
角膜損害≥1或
虹膜損害≥1或
結(jié)膜充血≥1或
結(jié)膜水腫≥1
≥1
>21
*:恢復(fù)時(shí)間:為動(dòng)物刺激反應(yīng)評(píng)分恢復(fù)*角膜損害=0,虹膜損害=0,結(jié)膜充血=0或1,結(jié)膜水腫=0或1
的時(shí)間。
**:腐蝕性:*少有1只動(dòng)物于21d尚存在角膜粘連或血管翳,也可判為腐蝕性。
2.3.5**黏膜刺激試驗(yàn)
2.3.5.1目的
檢測(cè)**劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物**黏膜的刺激作用和強(qiáng)度。
2.3.5.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選用健康、初成年的雌性白色家兔,同一品系,體重2.0kg~2.5kg。試驗(yàn)前應(yīng)檢查動(dòng)物**口有無(wú)分泌物、充血、水腫和其它損傷情況。如有炎癥或(和)損傷,應(yīng)棄用。*好選擇動(dòng)物的非動(dòng)情期做試驗(yàn)。
2.3.5.3試驗(yàn)分組
分為染毒組和對(duì)照組,每組3只。
表2-16 **黏膜刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
**組織反應(yīng)
反應(yīng)評(píng)分
a.上皮組織
正常,完好無(wú)損
0
細(xì)胞變性或變扁平
1
組織變形
2
局部糜爛
3
廣泛糜爛
4
b.白細(xì)胞浸潤(rùn)(每個(gè)高倍視野)
無(wú)
0
極少<25個(gè)
1
輕度26~50個(gè)
2
中度51~100個(gè)
3
重度>100個(gè)
4
c.血管充血
無(wú)
0
極少
1
輕度
2
中度
3
重度伴血管破裂
4
d.水腫
無(wú)
0
極少
1
輕度
2
中度
3
重度
4
刺激反應(yīng)積分=a+b+c+d
2.3.5.4操作程序
(1)稀釋使用的**劑采用黏膜**時(shí)應(yīng)用液5倍濃度的溶液作為受試液。若應(yīng)用液為原液的**劑則用原液作受試液。對(duì)照組采用生理鹽水。
(2)將長(zhǎng)度為8cm左右的鈍頭軟管與2ml的注射器連接。注射器和導(dǎo)管注滿受試液備用。每只動(dòng)物各準(zhǔn)備一套。
(3)一次**黏膜刺激試驗(yàn)的染毒方法:將動(dòng)物仰面固定,暴露出會(huì)陰和**口。將導(dǎo)管用受試液或?qū)φ找簼駶?rùn)后輕柔地插入**(4cm~5cm),并用注射器緩慢注入2ml受試液,抽出導(dǎo)管,完成染毒。對(duì)照組動(dòng)物用生理鹽水作同樣處理。
(4)多次**黏膜刺激試驗(yàn)的染毒方法:按上述2.3.5.4(3))的染毒方法,每隔24h重復(fù)染毒一次,連續(xù)5d。對(duì)照組動(dòng)物用生理鹽水作同樣處理。
(5)由于動(dòng)物**容積的個(gè)體差異,有時(shí)受試液注入后可能有溢出,可用**棉或軟紙拭去。
(6)末次染毒后24h,采用氣栓法處死動(dòng)物,剖腹取出完整的**,縱向切開(kāi),肉眼觀察是否有充血、水腫等表現(xiàn),供病理取材時(shí)參考。然后將**放入10%福爾馬林溶液中固定24h以上,選取**的兩端和*3個(gè)部位的組織制片,he染色后,進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
2.3.3.5結(jié)果評(píng)價(jià)
(1)組織病理學(xué)檢查結(jié)果,按表2-16規(guī)定對(duì)**黏膜的刺激反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分。
(2)將試驗(yàn)組3只動(dòng)物3個(gè)部位的刺激反應(yīng)積分相加后,再除以觀察總數(shù)(動(dòng)物數(shù)×3),得出試驗(yàn)組**黏膜刺激反應(yīng)的平均積分,*大記分為16(見(jiàn)表2-16)。對(duì)照組評(píng)分方法同上。
(3)將試驗(yàn)組平均積分減去對(duì)照組平均積分得出刺激指數(shù)后,按表2-17進(jìn)行刺激強(qiáng)度分級(jí)。
(4)當(dāng)對(duì)照組動(dòng)物**黏膜刺激反應(yīng)平均積分大于9時(shí),應(yīng)采用6只動(dòng)物進(jìn)行復(fù)試,以鑒別是否與操作損傷有關(guān)。
表2-17**黏膜刺激強(qiáng)度分級(jí)
**黏膜刺激指數(shù)
**黏膜刺激反應(yīng)強(qiáng)度
<1
無(wú)
1~<5
極輕
5~<9
輕度
9~<12
中度
≥12
重度
2.3.6 皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)
2.3.6.1目的
檢測(cè)**劑重復(fù)接觸后,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生皮膚變態(tài)反應(yīng)的可能性及其強(qiáng)度。
2.3.6.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選用皮膚完好的健康白色豚鼠,雌雄各半,體重200g~300g。
2.3.6.3 試驗(yàn)分組
將豚鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組,每組動(dòng)物*少16只。
2.3.6.4操作程序
(1)對(duì)試驗(yàn)組豚鼠,給予受試物誘導(dǎo)和激發(fā)處理。陽(yáng)性對(duì)照組給予陽(yáng)性致敏物(如:2,4-二硝基氯苯)誘導(dǎo)和激發(fā)處理。陰性對(duì)照組僅給以受試物激發(fā)處理。
(2)誘導(dǎo)處理濃度允許引起皮膚輕度刺激反應(yīng)。激發(fā)濃度低于誘導(dǎo)濃度,不得引起原發(fā)性刺激反應(yīng)。如果原液不引起皮膚刺激反應(yīng),誘導(dǎo)和激發(fā)均使用原液。
(3)于試驗(yàn)前24h將豚鼠背部左側(cè)3cm×3cm范圍內(nèi)去毛。取誘導(dǎo)濃度的**劑溶液(或原液)0.5ml(g),直接涂在2cm×2cm左側(cè)去毛皮膚上或滴于同樣大小的2層~4層紗布上,再將其敷貼在左側(cè)去毛區(qū)。用一層無(wú)刺激塑料膜或油紙復(fù)蓋,再以無(wú)刺激膠布固定,持續(xù)6h。第 7d和第 14d以同樣方法重復(fù)一次。
(4)在末次誘導(dǎo)后14d,將激發(fā)濃度的**劑溶液0.5ml(g)直接涂在2cm×2cm右側(cè)脫毛皮膚上或滴于同樣大小的2層~4層紗布上,敷貼于豚鼠背部右側(cè)3cm×3cm去毛區(qū)。然后,用一層塑料膜或油紙和無(wú)刺激膠布固定,6h后將敷貼的受試物洗去。24h和48h后觀察皮膚反應(yīng),按表2-17對(duì)皮膚反應(yīng)評(píng)分。
(5)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)初期,或使用新的動(dòng)物種屬或品系時(shí),需同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照物可使用2,4-二硝基氯代苯。為保證試驗(yàn)方法的可靠性,在進(jìn)行該類試驗(yàn)時(shí),每隔半年應(yīng)使用陽(yáng)性對(duì)照物檢查一次。若檢測(cè)報(bào)告中需用非本次陽(yáng)性對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí),應(yīng)注明其實(shí)驗(yàn)日期。陽(yáng)性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組,以陽(yáng)性致敏物替代受試物。
(6)陰性對(duì)照組,僅對(duì)動(dòng)物給予受試物的激發(fā)接觸,每次試驗(yàn)必須設(shè)置。
2.3.6.5評(píng)價(jià)規(guī)定
化學(xué)物質(zhì)引起的過(guò)敏性接觸性皮炎,屬遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。對(duì)于動(dòng)物,僅見(jiàn)皮膚紅斑和水腫。
根據(jù)表2-18標(biāo)準(zhǔn),將出現(xiàn)皮膚反應(yīng)(評(píng)分≥1)的動(dòng)物數(shù)除以該組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù),求得致敏率(%),按表2-1**定致敏強(qiáng)度。
表2-18皮膚反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
皮膚反應(yīng)評(píng)分
a紅斑形成:
無(wú)紅斑 0
輕微紅斑 1
中度紅斑 2
嚴(yán)重紅斑 3
水腫性紅斑 4
b水腫形成:
無(wú)水腫 0
輕度水腫 1
中度水腫 2
嚴(yán)重水腫 3
表2-19致敏強(qiáng)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
致敏率(%) 致敏強(qiáng)度
0~8 極輕度
9~28 輕度
29~64 中度
65~80 強(qiáng)度
81~100 *度
注:致敏率為0%時(shí),可判為未見(jiàn)皮膚變態(tài)反應(yīng)。
2.3.7 亞急性毒性試驗(yàn)
2.3.7.1目的
(1)檢測(cè)**劑多次接觸對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的蓄積毒性作用及其靶器官,并確定其*大未觀察到有害作用劑量和*小觀察到有害作用劑量。
(2)為亞慢性、慢性毒性或致癌試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供依據(jù)。
2.3.7.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
一般用嚙齒類動(dòng)物,優(yōu)選大鼠。所用大鼠應(yīng)為 6周齡~8 周齡,每組*少10只,雌雄各半。
2.3.7.3試驗(yàn)分組
將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組(3個(gè)劑量組和1個(gè)對(duì)照組)。選擇受試物劑量時(shí),高劑量組應(yīng)出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng),但不引起死亡,如果出現(xiàn)動(dòng)物死亡應(yīng)不超過(guò)10%;中間劑量組應(yīng)可觀察到輕微的毒性效應(yīng);低劑量組應(yīng)不引起任何毒性效應(yīng)(屬未觀察到有害作用劑量)。*于具體的劑量設(shè)計(jì),可考慮高劑量為ld50的1/5~1/10,高、中、低3個(gè)劑量間的組距以3倍~5倍為宜,*低不小于2倍。對(duì)于ld50>5000mg/kg的**劑,高劑量應(yīng)用1000mg/kg。另以受試物溶劑代替受試物進(jìn)行試驗(yàn),作為陰性(溶劑)對(duì)照組。
2.3.7.4操作程序
(1)采用灌胃方式經(jīng)口染毒。
(2)灌胃法每天灌胃一次,每周稱體重,并按體重調(diào)整受試物的給予量。
(3)試驗(yàn)期為28d~30d,末次染毒后24h檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo),然后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,做病理學(xué)檢查。
2.3.7.5觀察指標(biāo)
可因**劑毒理作用不同而有差異,一般應(yīng)包括下列各方面。
(1)臨床檢查。觀察動(dòng)物中毒表現(xiàn),每周稱量體重一次。
(2)血液學(xué)檢查。包括血紅蛋白含量、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)及其分類計(jì)數(shù)等。
(3)血液生物化學(xué)檢查。例如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、*氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素氮、肌酐、血清總蛋白和白蛋白、總*等。必要時(shí),可根據(jù)所觀察到的受試物毒性效應(yīng),或與受試物化學(xué)結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)的毒性作用,選擇其他一些生化指標(biāo)。
(4)臟器重量。測(cè)量肝、腎重量,并計(jì)算其臟器重量系數(shù)(臟器重 / 體重×100%)。
(5)病理學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),處死所有動(dòng)物,進(jìn)行**的肉眼尸檢,并將尸檢發(fā)現(xiàn)的異常組織和主要臟器和組織(如心、肺、肝、腎、脾、腦、腎上腺、睪丸、卵巢和胃腸等)固定保存。當(dāng)各劑量組動(dòng)物尸檢未發(fā)現(xiàn)明顯病變時(shí),*行高劑量組和陰性對(duì)照組動(dòng)物的肝、腎、胃腸和其它可能受損的臟器的組織病理學(xué)檢查。如發(fā)現(xiàn)病變,還應(yīng)對(duì)中、低劑量組動(dòng)物相應(yīng)的器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
2.3.7.6評(píng)價(jià)規(guī)定
將各試驗(yàn)組動(dòng)物觀察指標(biāo)與陰性對(duì)照組加以比較,并進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),注意各劑量組間的劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系。評(píng)定受試物的*小觀察到有害作用劑量和*大未觀察到有害作用劑量及毒性作用的靶器官。
2.3.8 致突變?cè)囼?yàn)
2.3.8.1 l5178y 細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)
2.3.8.1.1 目的
檢測(cè)**劑對(duì)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因突變作用,以作為評(píng)價(jià)**劑致突變性的依據(jù)。
2.3.8.1.2 試劑
(1)f10p培養(yǎng)液: 為*培養(yǎng)液。以fischer或rpmi1640培養(yǎng)液,加入馬血清10%,丙酮酸鈉220μg/ml,*100iu/ml和*100μg/ml配制而成(ph為7.2~7.4)。于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> (2)f0p培養(yǎng)液:為無(wú)血清培養(yǎng)液。以fischer或rpmi1640培養(yǎng)液,加入丙酮酸鈉220μg/ml,*100 iu/ml和*100μg/ml等配制而成(ph為7.2~7.4)。于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>(3)馬血清:將過(guò)濾**后的馬血清,經(jīng)56℃作用30min滅活補(bǔ)體。分裝后,于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (4)集落用培養(yǎng)基:用fischer或rpmi1640培養(yǎng)液,加入馬血清20%、丙酮酸鈉220μg/ml、瓊脂0.37%配制而成。
(5)無(wú)鈣鎂磷酸鹽緩沖液(無(wú)鈣鎂pbs,ph為7.2~7.4):
磷酸二氫鉀(kh2po4)0.20g
*(na2hpo4.12h2o)2.89g
氯化鉀(kcl)0.20g
氯化鈉(nacl)8.00g
雙蒸水(壓力蒸汽**)1000ml
(6)受試物:*好能直接溶于f10p與f0p培養(yǎng)液中。否則需先溶于二甲基亞砜(dmso),而后再加于上述培養(yǎng)液內(nèi)。所加dmso的量應(yīng)低于1%(v/v)。
(7)陽(yáng)性對(duì)照物:選用甲基磺酸乙酯(ems),c(mmc),甲基硝基亞硝基胍(mnng),苯并(a)芘 (bap) 等。
(8)*(tft):用生理鹽水配成100μg/ml溶液,可凍存3個(gè)月。
(9)肝微粒體酶混合液(s9 混合液):取健康的雄性成年sd或wistar大鼠,體重150g左右,約5周齡~6周齡。將多氯聯(lián)苯(aroclor1254),溶于玉米油中,濃度200mg/ml,按500mg/kg體重一次腹腔注射。5d后,斷頭處死動(dòng)物,取出肝臟稱重后,用預(yù)冷的0.15mol/l氯化鉀溶液沖洗肝臟數(shù)次。每克肝(濕重)加0.15mol/l氯化鉀溶液3ml。剪碎肝臟,在冰浴中用玻璃勻漿器制成肝勻漿。以上操作需注意無(wú)菌和局部冷環(huán)境。
將肝勻漿用低溫(0℃~4℃)高速離心機(jī),以9000g離心10min。取上清液即為s9,分裝于無(wú)菌冷凍安瓿中。s9制成后,需進(jìn)行無(wú)菌檢查,以及用間接致癌物鑒定其活性。合格者置-80℃或液氮中儲(chǔ)存?zhèn)溆?,?chǔ)存期不超過(guò)1年。
s9混合液應(yīng)以上述s9 液在臨用時(shí)按無(wú)菌要求配制。一般配成含10% s9的混合液。其配方如下:
s90.10ml
1.65mo1/l氯化鉀 + 0.4 mol/l氯化鎂0.04ml
葡萄糖-6-磷酸.2na1.8mg
氧化型輔酶 ii(nadp)3.1mg
用f0p培養(yǎng)液補(bǔ)足* 1.0ml
2.3.8.1.3細(xì)胞
試驗(yàn)以小鼠**瘤l5178y細(xì)胞[胸苷激酶(tk) 座位為雜合子 (tk+/tk-)] 檢測(cè) tk基因的突變。為減少細(xì)胞的自發(fā)突變率,在制備該細(xì)胞試驗(yàn)用懸液時(shí),先將其在加有 thmg 的 f10p培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h,殺滅培養(yǎng)液中所存在的自發(fā)突變細(xì)胞 (tk-/tk-),然后將細(xì)胞懸浮于thg 培養(yǎng)液(不含氨甲喋呤的 thmg培養(yǎng)液)中培養(yǎng) 1d~3d。
[thmg 含下列4種成分,各成分的終末濃度如下:
胸苷 5×10-6mol/l
次黃嘌呤5×10-5 mol/l
氨甲喋呤4×10-7 mol/l
* 1×10-4 mol/l]
2.3.8.1.4 試驗(yàn)分組
一般設(shè)4個(gè)劑量組。對(duì)有細(xì)胞毒性的受試物,*高劑量組的細(xì)胞存活率為10%~20%,無(wú)細(xì)胞毒性受試物*高劑量不超過(guò)10mmol/l或5mg/ml。同時(shí)應(yīng)有陰性(溶劑)對(duì)照組、未處理對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。除未處理對(duì)照組外,試驗(yàn)組和其它對(duì)照組,還均應(yīng)包括有加s9混合液和不加s9 混合液兩大部分。
2.3.8.1.5 操作程序
(1)細(xì)胞準(zhǔn)備:將新**了自發(fā)突變體的細(xì)胞群體,用f10p培養(yǎng)液制成懸液。以無(wú)菌燒瓶加入細(xì)胞懸液和f10p培養(yǎng)液*100 ml,細(xì)胞終末密度為7×103個(gè)/ml~8×103個(gè)/ml。培養(yǎng)物以含5%二氧化碳的空氣充氣后,加蓋密閉,于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。l5178y細(xì)胞的細(xì)胞殖周期約為10h~11h,在常規(guī)培養(yǎng)24h后,細(xì)胞數(shù)將增加約5倍。用稀釋法維持生長(zhǎng),每天將細(xì)胞培養(yǎng)物用f10p培養(yǎng)液作4倍稀釋(或隔天用f10p培養(yǎng)液作24倍稀釋),繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前**用f10p培養(yǎng)液和f0p 培養(yǎng)液各50% 的對(duì)半混合液(馬血清終末濃度為 5%) 稀釋。
(2)受試物處理:用上述f10p和f0p 的對(duì)半混合液將細(xì)胞培養(yǎng)物稀釋*1×106 個(gè)/ml,并分種于50ml有蓋試管中,每管6ml,再加s9混合液4ml(總量共10ml)。不加s9混合液管,代之以f0p培養(yǎng)液。在上述試管內(nèi)加入一定濃度的受試物,并以含5%二氧化碳的空氣充氣后加蓋密閉,于37℃培養(yǎng)4h。
處理結(jié)束后,以200g離心10min,除去含受試物的上清液,收集細(xì)胞。細(xì)胞用hanks液洗滌,再加入20mlf10p培養(yǎng)液充分混懸(細(xì)胞濃度為0.3×l06 個(gè)/ml),以含 5%二氧化碳的空氣充氣后,加蓋密閉,于37℃ 振蕩培養(yǎng),開(kāi)始表達(dá)。
(3)表達(dá):細(xì)胞的表現(xiàn)型表達(dá)時(shí)間為2d。表達(dá)開(kāi)始后24和48h經(jīng)計(jì)數(shù)后將細(xì)胞稀釋*3×105 個(gè)/ml。
(4)選擇和集落化:表達(dá)結(jié)束后,取10ml培養(yǎng)物經(jīng)離心后除去大部分上清液。并將細(xì)胞在留下的約1mlf10p培養(yǎng)基中混懸。將細(xì)胞懸液移入含100ml集落培養(yǎng)基的燒瓶中。此時(shí)細(xì)胞密度為3×l04個(gè)/ml。在37℃振蕩培養(yǎng) 30min。取出 0.5ml后,向余下的細(xì)胞懸液中加入 1.0ml tft 貯存液,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)15min。將樣本取出,倒于3個(gè)10cm平皿中,每平皿33ml,含1×l06個(gè)細(xì)胞(稱為tft平板),作突變體的選擇。將先前取出的0.5ml細(xì)胞懸液用集落培養(yǎng)基先作1:100稀釋,細(xì)胞懸液濃度為3×l02個(gè)/ml。振蕩培養(yǎng)15min 后,取出2.0ml 再用集落培養(yǎng)基作 1:50 稀釋(此時(shí)細(xì)胞懸液濃度為 6個(gè)/ml) 后振蕩培養(yǎng)。經(jīng)15min培養(yǎng)后,倒入3個(gè)直徑為100mm的平皿中,每平皿33ml,含細(xì)胞200個(gè)(稱為vc平板)。待瓊脂凝固后,置二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃)中靜置培養(yǎng)10d。計(jì)數(shù)各個(gè)平皿中出現(xiàn)的集落數(shù),計(jì)算集落形成效率(cfe)。
(5)陽(yáng)性與陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組,僅陽(yáng)性對(duì)照組用陽(yáng)性對(duì)照物代替受試物,陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑代替受試物。另設(shè)一未處理對(duì)照組。
(6)按下列公式計(jì)算有關(guān)指標(biāo):
優(yōu)良cfe = (形成集落數(shù) / 接種細(xì)胞數(shù))
相對(duì)cfe = (試驗(yàn)組優(yōu)良cfe / 溶劑對(duì)照組優(yōu)良cfe) × 100%
突變頻率(mf) = (tft平皿集落數(shù) / vc平皿集落數(shù)) × 稀釋系數(shù)
(在此,稀釋系數(shù)為 2×l0-4)。
2.3.8.1.6評(píng)價(jià)規(guī)定
(1)對(duì)l5178y 細(xì)胞,推薦可接受的自發(fā)突變頻率范圍為20/106~100/106個(gè)存活細(xì)胞。
(2)用適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,當(dāng)各劑量組mf與陰性(溶劑)對(duì)照組者相比突變率,有顯著性意義的增加,并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí),或僅一個(gè)劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)者,均可判為陽(yáng)性結(jié)果,即受試物對(duì)l5178y細(xì)胞 tk 系統(tǒng)有致突變性。
2.3.8.2v79 細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)
2.3.8.2.1目的
檢測(cè)**劑對(duì)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可否引起基因突變,以對(duì)**劑的致突變性做出評(píng)價(jià)。
2.3.8.2.2試劑
(1)*培養(yǎng)液:以eagle*低必需培養(yǎng)液(emem)或rpmi1640培養(yǎng)液加10%小牛血清、*(100iu/ml) 和* (100μg/ml) 配制而成。
(2)小牛血清:將過(guò)濾**后的小牛血清放入56℃水浴中,保溫30min以滅活補(bǔ)體,而后分裝,保存于-20℃?zhèn)溆谩?br>(3)無(wú)鈣鎂磷酸鹽緩沖液(無(wú)鈣鎂pbs):見(jiàn)2.3.8.1.2(5)。
(4)*-edta溶液:分別用無(wú)鈣鎂 pbs 配制*與edta溶液,*溶液濃度為0.05%,edta溶液濃度為0.02%。兩溶液按1:1混合。存放于-20℃ 備用。
(5)受試物:*好能直接溶于無(wú)血清培養(yǎng)液內(nèi)。否則,需先溶于二甲基亞砜(dmso),而后加于無(wú)血清培養(yǎng)液內(nèi)。所加dmso溶液量為0.5%(v/v)。
(6)陽(yáng)性對(duì)照物:可根據(jù)受試物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選用不同的陽(yáng)性對(duì)照物,例如甲基磺酸乙酯(ems),c(mmc),甲基硝基亞硝基胍(mnng),苯并(α)芘(bap)等。
(7)6-硫代*(6-tg): 用0.5% *溶液配制為1.0mg/ml 溶液,保存于4℃?zhèn)溆谩?br>(8)肝微粒體酶混合液(s9混合液):見(jiàn)2.3.8.1.2 (9)。
(9)姬姆薩染液: 取姬姆薩染料3.8g,置瑪瑙乳缽中,加少量甲醇研磨。逐漸加甲醇*375ml,待*溶解后,再加125ml甘油,放入37℃溫箱中保溫48h。保溫期間振搖數(shù)次,使充分溶解。取出過(guò)濾,2周后使用,作為姬姆薩染液原液。
使用時(shí),取1份姬姆薩染液原液,與9份1/15mol/l磷酸鹽緩沖液(ph6.8) 混合,配成其應(yīng)用液。
磷酸鹽緩沖液(1/15mol/l,ph6.8)配制方法如下:
**液:取*9.47g溶于蒸餾水1000ml中,配成1/15mol/l溶液。
**液:取磷酸二氫鉀49.07g溶于蒸餾水1000ml中,配成1/15mol/l溶液。
取**液49.5ml加于**液50.5ml中混勻,即為ph6.8的1/15mol/lpbs。
2.3.8.2.3細(xì)胞
以中國(guó)倉(cāng)鼠肺(v79)細(xì)胞株進(jìn)行試驗(yàn)。為減少其自發(fā)突變,正式試驗(yàn)前將野生型細(xì)胞接種于含thmg(見(jiàn)2.3.8.1.3)的mem培養(yǎng)液內(nèi)并在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周,以殺滅自發(fā)hgprt位點(diǎn)突變體。遂后重新接種于mem培養(yǎng)液中。
2.3.8.2.4試驗(yàn)分組
一般設(shè)4個(gè)試驗(yàn)劑量組。對(duì)有細(xì)胞毒性的受試物,*高劑量組的細(xì)胞存活率為10%~20%,無(wú)細(xì)胞毒性受試物*高劑量不超過(guò)10mmol/l(或5mg/ml)。同時(shí),應(yīng)設(shè)陰性(溶劑)對(duì)照組、未處理對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。除未處理對(duì)照組外,各組均應(yīng)包括加s9混合液和不加該液的樣本。
2.3.8.2.5操作程序
(1)細(xì)胞準(zhǔn)備:將5×105個(gè)細(xì)胞接種于含*培養(yǎng)液的直徑為100mm的平皿中,除未處理對(duì)照組外,每組2皿共13皿。于二氧化碳培養(yǎng)箱中(37℃)培養(yǎng)24h。
(2)接觸受試物:吸去上述供試培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液,用無(wú)鈣鎂pbs洗2次。將含有細(xì)胞的培養(yǎng)皿分為二大組,一組加s9混合液,另一組不加s9混合液。加s9混合液組,在培養(yǎng)皿中加入2mls9混合液,對(duì)不加s9混合液組,則用2ml無(wú)血清培養(yǎng)液代替,再加一定量不同濃度受試物的供試液,*后用不含血清的培養(yǎng)液補(bǔ)足*10ml。并將培養(yǎng)皿置co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h,處理結(jié)束后,吸去培養(yǎng)皿中液體部分,用無(wú)鈣鎂pbs洗滌細(xì)胞2次,再加入*培養(yǎng)液10ml,在co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)19h~22h。陽(yáng)性和陰性(溶劑)對(duì)照組也分加與不加s9混合液兩大組,操作方法同上。
(3)表達(dá):將培養(yǎng)物用*-edta消化。待細(xì)胞脫落后,加入*培養(yǎng)液,終止消化?;靹颉⒂?jì)數(shù)并進(jìn)行表達(dá)和細(xì)胞毒性測(cè)定[見(jiàn)2.3.8.2.5(4)]。表達(dá)時(shí),以5×105 個(gè)細(xì)胞接種于直徑為100mm的平皿中。培養(yǎng)3天后,分傳一次,仍接種5×105個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)3天后再進(jìn)行突變體的選擇及集落形成效率(cfe)的測(cè)定。
(4)細(xì)胞毒性測(cè)定:將上述消化計(jì)數(shù)后的細(xì)胞,每平皿接種200個(gè),每組5個(gè)平皿,于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃)培養(yǎng)7d。取出樣本,固定并進(jìn)行姬姆薩染色后,計(jì)數(shù)各平皿的細(xì)胞集落數(shù)。以相對(duì)cfe值表示細(xì)胞的毒性。
(5)突變體的選擇及集落形成率的測(cè)定: 表達(dá)結(jié)束后,消化細(xì)胞,分別接種,每組5個(gè)平皿,每平皿種2×105個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后加入 6-tg,終末濃度為5μg/ml。放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d~10d。固定后進(jìn)行姬姆薩染色,計(jì)數(shù)平皿內(nèi)集落數(shù),并計(jì)算其突變頻率(mf)。
(6)陽(yáng)性與陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組,僅陽(yáng)性對(duì)照組用陽(yáng)性對(duì)照物代替受試物,陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑代替受試物。另設(shè)一陰性(未處理)對(duì)照組。
(7)按下列公式計(jì)算有關(guān)指標(biāo):
優(yōu)良 cfe =(形成集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))
相對(duì)cfe = (試驗(yàn)組優(yōu)良cfe/溶劑對(duì)照組優(yōu)良cfe) × 100%
突變頻率(mf) = (突變集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)) ×(1/優(yōu)良cfe)
2.3.8.2.6評(píng)價(jià)規(guī)定
(1)對(duì)v79細(xì)胞,推薦可接受的自發(fā)突變頻率范圍為10/106~100/106個(gè)存活細(xì)胞。
(2)用適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,當(dāng)各劑量組mf與陰性(溶劑)對(duì)照組者相比,突變率有顯著性意義的增加,并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí),或僅一個(gè)劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)者,均可判為陽(yáng)性結(jié)果,即受試物對(duì)v79 細(xì)胞 hgprt 系統(tǒng)有致突變性。
2.3.8.3體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)
2.3.8.3.1目的
用細(xì)胞遺傳學(xué)方法檢測(cè)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變,評(píng)價(jià)**劑的致突變性。
2.3.8.3.2試劑
(1)*培養(yǎng)液:采用 eagle*低必需培養(yǎng)液(emem)或dulbecco *低必需培養(yǎng)液(dmem)等,并加入 10%小牛血清以及*(100iu/ml) 和*(100μg/ml)。
(2)小牛血清:將過(guò)濾**后的小牛血清,放人56℃恒溫水浴中,保溫30min滅活補(bǔ)體。處理后分裝,保存于-20℃?zhèn)溆谩?br>(3)無(wú)鈣鎂磷酸緩沖液[無(wú)鈣鎂pbs,ph為7.2~7.4。見(jiàn)2.3.8.1.2(5)]。
(4)*-edta:見(jiàn)2.3.8.2.2(4)。
(5)受試物:*好能直接溶于無(wú)血清*培養(yǎng)液內(nèi)。否則,需先溶于二甲基亞砜(dmso),而后加于*培養(yǎng)液內(nèi)。所加dmso溶液量應(yīng)低于1.0%(v/v)。
(6)陽(yáng)性對(duì)照物:加s9時(shí)選用*等,不加s9時(shí)選用c等。
(7)肝微粒體酶混合液(s9混合液):見(jiàn)2.3.8.1.2(9)。
(8)秋水仙素溶液(0.04%):取40mg秋水仙素溶解于100ml無(wú)菌0.85%氯化鈉溶液中,過(guò)濾**。
(9)氯化鉀溶液(0.075mol/l)。
(10)甲醇/冰醋酸(3:1,v/v) 固定液: 臨用現(xiàn)配。
(11)姬姆薩染液:見(jiàn)2.3.8.2.2(9)。
2.3.8.3.3細(xì)胞
可選用中國(guó)倉(cāng)鼠肺(chl)細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠肺 (v79) 細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (cho)細(xì)胞,或人外周血**細(xì)胞等進(jìn)行試驗(yàn)。
在一般情況下,本試驗(yàn)推薦使用chl細(xì)胞。 使用chl 細(xì)胞時(shí),在試驗(yàn)前**,將其1×l06個(gè)細(xì)胞接種于直徑為100mm平皿中,置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)待用。
2.3.8.3.4試驗(yàn)分組
所設(shè)試驗(yàn)劑量組應(yīng)不少于4個(gè)。*高劑量組的細(xì)胞存活率應(yīng)為10%~20%,無(wú)毒性受試物*高劑量組不超過(guò)10mmol/l(或5mg/ml)。同時(shí),應(yīng)設(shè)陰性(溶劑)對(duì)照組、未處理對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。除未處理對(duì)照組外,各組均應(yīng)包括加s9混合液和不加該液的樣本。
2.3.8.3.5操作程序
(1)試驗(yàn)時(shí),吸出細(xì)胞培養(yǎng)平皿中的培養(yǎng)液,加入試驗(yàn)所規(guī)定濃度的受試物和s9混合物(10%)以及不含小牛血清的*培養(yǎng)液,放二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)作用2h。結(jié)束后,吸去*培養(yǎng)液,用hanks液洗細(xì)胞3次。加*培養(yǎng)液,再置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于24h收獲細(xì)胞。收獲細(xì)胞之前2h~4h,加入秋水仙素溶液(終末濃度為1μg/ml),阻斷細(xì)胞于有絲分裂中期相。
(2)收獲細(xì)胞時(shí),用*-edta溶液消化細(xì)胞,待細(xì)胞脫落,加入培養(yǎng)液并混勻以終止*作用。離心(1000r/min~1200r/min,5min~7min),棄去上清液后,加入0.075mol/l氯化鉀溶液低滲處理10min~20min。離心后,再以甲醇/冰醋酸液固定2次。按常規(guī)滴片干燥,用姬姆薩應(yīng)用液染色15min 左右。
(3)陽(yáng)性與陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組,只是陽(yáng)性對(duì)照組用已知染色體斷裂劑替代受試物。陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物的溶劑。另設(shè)一未處理對(duì)照組。
(4)觀察:每組各選100個(gè)染色體分散良好的中期分裂相細(xì)胞,進(jìn)行染色體畸變分析,觀察和記錄染色體結(jié)構(gòu)的異常及數(shù)量異常。
染色體結(jié)構(gòu)異常可有:斷裂,微小體,有著絲點(diǎn)環(huán),無(wú)著絲點(diǎn)環(huán),單體互換,雙微小體,裂隙,非特定性型變化(粉碎化等)。染色體數(shù)量異常可有:非整倍體,多倍體,內(nèi)復(fù)制。
2.3.8.3.6評(píng)價(jià)規(guī)定
用χ2檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法,對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與陰性(溶劑)對(duì)照組相比,畸變細(xì)胞率的增加有顯著性意義,并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí);或僅一個(gè)劑量組有顯著性意義的增加,并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)時(shí),可判為該受試物在本試驗(yàn)中具有致突變性。
2.3.8.4小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)
2.3.8.4.1 目的
檢測(cè)**劑對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成的影響,評(píng)價(jià)**劑的染色體損傷毒性。
2.3.8.4.2試劑
(1)受試物: 用水、植物油或用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成溶液或混懸液。
(2)陽(yáng)性對(duì)照物: 常用*或c。
(3)小牛血清:見(jiàn)2.3.8.3.2(2)。
(4)姬姆薩染液:見(jiàn)2.3.8.2.2(9)。
2.3.8.4.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選用體重為25g~30g的小鼠,雌雄各半,隨機(jī)分組。
2.3.8.4.4試驗(yàn)分組
受試物*少設(shè)3個(gè)劑量組,每個(gè)劑量組用10只動(dòng)物,雌雄各半。另設(shè)陰性(溶劑)和陽(yáng)性對(duì)照組。劑量組一般取受試物的1/2ld50、1/5ld50、1/20ld50等劑量,以得到劑量-反應(yīng)關(guān)系。高劑量組應(yīng)不引起動(dòng)物死亡,不引起明顯骨髓抑制。若采用一次*大限度試驗(yàn)測(cè)得ld50大于5000mg/kg體重,即以5000mg/kg體重為高劑量。
2.3.8.4.5操作程序
(1)動(dòng)物染毒采用經(jīng)口灌胃30h 染毒法,即兩次染毒間隔24h,**次染毒后6h取材。
(2)用頸椎脫臼法處死動(dòng)物,取股骨或胸骨。剝除肌肉,擦凈血污。切斷股骨或胸骨兩端,暴露骨髓腔。
(3)用注射器吸取0.1ml小牛血清,沖洗骨髓腔。用沖洗液常規(guī)涂片,晾干或熱風(fēng)吹干。
(4)將已干的涂片,在甲醇中固定5min~10min。用姬姆薩應(yīng)用液染色10min~15min,然后用ph6.8pbs液沖洗,晾干。
(5)陽(yáng)性與陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組。陽(yáng)性組選用*(40mg/kg體重)或(1mg/kg~1.5mg/kg體重)。陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑。
(6)選擇細(xì)胞分布均勻、完整、著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域。在油鏡下計(jì)數(shù)含微核的嗜多染紅細(xì)胞(pce)數(shù)。pce呈灰藍(lán)色[成熟紅細(xì)胞(nce)呈粉紅色],微核多呈圓形、邊緣光滑、整齊,嗜色性與有核細(xì)胞核質(zhì)一致,呈紫紅色或藍(lán)紫色。直徑通常為紅細(xì)胞的1/20~1/5。
(7)每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)pce。微核細(xì)胞率指含有微核的pce數(shù),以千分率表示。1個(gè)pce中出現(xiàn)有2個(gè)或多個(gè)微核,仍按1個(gè)計(jì)數(shù)。此外,還應(yīng)觀察pce/nce比例,作為對(duì)細(xì)胞毒性的指標(biāo)。一般計(jì)數(shù)200個(gè)pce,同時(shí)記數(shù)所見(jiàn)到的nce。當(dāng)pce/nce小于0.1時(shí),提示對(duì)骨髓具有明顯抑制作用,應(yīng)降低受試物劑量,重新進(jìn)行試驗(yàn)。
2.3.8.4.6評(píng)價(jià)規(guī)定
陰性對(duì)照組小鼠,微核細(xì)胞率一般不超過(guò)0.3%。
用波松分布 u檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性試驗(yàn)方法,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與溶劑對(duì)照組相比,微核細(xì)胞率的增加有顯著性意義,并有劑量-反應(yīng)關(guān)系,或僅一個(gè)劑量組微核細(xì)胞率增加有顯著性意義,并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)時(shí),均可判為受試物具有體內(nèi)染色體損傷作用。
2.3.8.5哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)
2.3.8.5.1 目的
用細(xì)胞遺傳學(xué)方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變率,以評(píng)價(jià)**劑的致突變性。
2.3.8.5.2試劑
(1)陽(yáng)性對(duì)照物: 常用*,c等。
(2)秋水仙素(0.04%):取40mg秋水仙素溶解于100ml無(wú)菌的0.85% 氯化鈉溶液中,過(guò)濾**。
(3)氯化鉀溶液(0.075mol/l)。
(4)甲醇/冰醋酸(3:1,v/v)固定液:臨用現(xiàn)配。
(5)姬姆薩染液[見(jiàn)2.3.8.2.2(9)]。
(6)磷酸鹽緩沖液(pbs,1/15mol/l,ph7.4)。
2.3.8.5.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
成年小鼠(體重25g~30g),或大鼠(體重180g~220g)。動(dòng)物總數(shù)不少于30只,雌雄各半。
2.3.8.5.4試驗(yàn)分組
隨機(jī)分為5組。*少3個(gè)受試物劑量組,為1/2ld50、1/5ld50、1/20ld50。若采用一次*大限度試驗(yàn),測(cè)得ld50大于5000mg/kg體重,即以5000mg/kg體重為高劑量。另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組和陰性(溶劑)對(duì)照組,每組6只動(dòng)物,雌雄各半。陽(yáng)性對(duì)照組可用*(40mg/kg體重)或c(1.5mg/kg~2mg/kg體重)。陰性(溶劑)對(duì)照組采用受試物溶劑。
2.3.8.5.5操作程序
(1)用經(jīng)口灌胃方式,共染毒兩次,間隔24h。于**次染毒后6h處死動(dòng)物。處死動(dòng)物前2h~4h腹腔注射0.04%秋水仙素溶液,劑量為4mg/kg體重。
(2)用頸椎脫臼法處死動(dòng)物,取出股骨,剔除肌肉等組織。
(3)剪去股骨兩端,用注射器吸取5ml生理鹽水,從股骨一端注入,用10ml離心管從股骨另一端接取流出的骨髓細(xì)胞懸液。
(4)將骨髓細(xì)胞懸液離心(1000r/min,5min~7min),除上清液。加0.075mol/l氯化鉀溶液7m1,用滴管將細(xì)胞輕輕混勻,置37℃水浴中低滲處理7min。
(5)加入2ml甲醇/冰醋酸固定液,混勻。離心(1000r/min,5min~7min),棄上清液。再加入7ml固定液,混勻,固定7min。離心(1000r/min,7min),棄去上清液。
(6)用同法再固定1次~2次,棄上清液,加入數(shù)滴新鮮固定液,混勻。
(7)用懸液滴片,晾干,以姬姆薩應(yīng)用液染色。
(8)每組各選100個(gè)染色體分散良好的中期分裂相細(xì)胞,進(jìn)行染色體畸變分析,觀察和記錄染色體結(jié)構(gòu)的異常和數(shù)量的異常。染色體結(jié)構(gòu)異??捎?斷裂、微小體、有著絲點(diǎn)環(huán)、單體互換、雙微小體、裂隙、粉碎化等。染色體數(shù)量的異??捎?非整倍體、多倍體、內(nèi)復(fù)制等。
(9)計(jì)算畸變細(xì)胞率?;兗?xì)胞率為100個(gè)中期分裂相細(xì)胞中有染色體畸變的細(xì)胞數(shù)。一個(gè)中期分裂相細(xì)胞出現(xiàn)兩種或多種畸變,仍按一個(gè)有染色體畸變細(xì)胞計(jì)。
(10)陽(yáng)性與陰性(溶液)對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組。只是陽(yáng)性組選用*(40mg/kg體重)或(1.5mg/kg~2.0mg/kg體重)作為受試物的替代物。陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑作為受試物的替代物。
2.3.8.5.6評(píng)價(jià)規(guī)定
用χ2檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與陰性(溶劑)對(duì)照組相比,畸變細(xì)胞率的增加有顯著性意義,并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí);或僅一個(gè)劑量組畸變細(xì)胞率增加有顯著性意義,并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)時(shí),可判為該受試物在本試驗(yàn)中具有致突變性。
2.3.8.6程序外dna修復(fù)合成試驗(yàn)
2.3.8.6.1目的
檢測(cè)受試物是否可引起體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原發(fā) dna 損傷。推薦用放射自顯影法進(jìn)行測(cè)定。
2.3.8.6.2試劑
(1)*培養(yǎng)液:用eagle*低要求培養(yǎng)基(emem)85份加小牛血清15 份,*(終末濃度100iu/ml)與*(終末濃度100μg/ml),ph為7.2~7.4。過(guò)濾**后,保存于4℃冰箱備用。
(2)同步培養(yǎng)液:用不含*的emem培養(yǎng)基 98 份,加小牛血清 2份,再加*(終末濃度100iu/ml)與*(終末濃度為100μg/ml)配制而成。
(3)小牛血清:見(jiàn)3.11.2.2 2)。
(4)無(wú)鈣鎂磷酸鹽緩沖液(無(wú)鈣鎂pbs):見(jiàn)2.3.8.1.2(5)。
(5)*-edta溶液:見(jiàn)2.3.8.2.2(4)。
(6)甲醇/冰醋酸(3:1,v/v) 固定液:臨用現(xiàn)配。
(7)*(hu)貯備液:250mmol/l。
(8)1% *溶液。
(9)3h-胸腺嘧啶核苷
(10)ntb-2 核乳膠或國(guó)產(chǎn)核-4乳膠。
(11)肝微粒體酶混合液(s-9混合液):見(jiàn)2.3.8.1.2(9)。
(12)顯影液及定影液:包括柯達(dá)(kodak)d-196顯影液、停顯液及 f-5 定影液。
2.3.8.6.3細(xì)胞
可選用人成纖維細(xì)胞、大鼠原代肝細(xì)胞、外周血**細(xì)胞等進(jìn)行試驗(yàn)。本規(guī)范推薦使用人胚肺成纖維細(xì)胞(2bs)。
2.3.8.6.4試驗(yàn)分組
受試物可設(shè)4個(gè)劑量組。*高劑量組應(yīng)使細(xì)胞存活率在10%~20%之間。無(wú)毒性受試物*高劑量不超過(guò)10mmol/ml。同時(shí)應(yīng)有陰性(未處理、溶劑) 對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。
2.3.8.6.5操作程序
人胚肺成纖維細(xì)胞(2bs)放射自顯影法操作程序。
(1)將細(xì)胞增殖*所需數(shù)量后,用*培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液,濃度為0.5×105個(gè)/ml~1.0×105個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液接種置有小蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1d~3d,*細(xì)胞50%融合。每一劑量組和各對(duì)照組分別作2個(gè)~3個(gè)平行樣本。
(2)換用同步培養(yǎng)液,培養(yǎng) 3d。
(3)在試驗(yàn)的前一日下午,加入*(hu)貯備液使hu的終末濃度為10mmol/l。繼續(xù)在37℃下培養(yǎng)16h,然后將上述長(zhǎng)有細(xì)胞之蓋片置于含有不同濃度的受試物、hu(10mmol/l)及3h -胸腺嘧啶核苷(5μci/ml~10μci/ml,30ci/mmol)同步培養(yǎng)液中。在37℃培養(yǎng)5h。
(4)陽(yáng)性及陰性對(duì)照組的操作程序同試驗(yàn)組,只是陽(yáng)性對(duì)照組用陽(yáng)性對(duì)照物代替受試物,陰性(溶劑)對(duì)照組用受試物溶劑代替受試物。
(5)處理結(jié)束后,用hanks液洗滌3次,再用1%枸掾酸鈉溶液處理10min。將小蓋玻片用甲醇-冰醋酸固定液固定30min,重復(fù)2次。干燥過(guò)夜,將有細(xì)胞的蓋玻片用少量中性樹(shù)膠,粘固于載玻片上,長(zhǎng)有細(xì)胞的一面朝上。
(6)在暗室中,將適量之ntb-2乳膠(或核-4乳膠)移入浸漬用之玻璃器皿中,置40℃水浴中融化,再加入等量40℃蒸餾水,繼續(xù)在水浴中加溫,用玻璃棒輕輕攪拌10min~20min,使氣泡逸出。同時(shí)將準(zhǔn)備做自顯影處理的載玻片,置水浴箱平臺(tái)上預(yù)熱。而后,將附有樣本的載玻片垂直浸漬于乳膠液中約5s。提出玻片,拭去其背面乳膠并待其干固。
(7)將干固的附有樣本的載玻片置于有變色硅膠干燥劑袋的曝光盒中,盒外包黑色避光紙,于4℃冰箱中曝光10d。曝光后,將玻片在d-19顯影液中顯影4min,在停顯液中漂洗30s,在f-5定影液中定影10min,再用水漂洗數(shù)小時(shí)。
(8)細(xì)胞在顯影后用姬姆薩染液染色,脫水透明后,用蓋片封固。在油鏡下,計(jì)數(shù)各樣本細(xì)胞核的顯影銀粒數(shù),每個(gè)樣本計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,同時(shí)計(jì)數(shù)相當(dāng)面積的本底銀粒數(shù),兩者之差為細(xì)胞核凈銀粒數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組和對(duì)照組銀粒數(shù)/核的均值及其標(biāo)準(zhǔn)差。
2.3.8.6.6評(píng)價(jià)規(guī)定
用t檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各試驗(yàn)劑量組銀粒數(shù)/核均值與陰性(溶劑)對(duì)照組者相比,有顯著性意義的增加,并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí);或僅一個(gè)劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加,但經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)者,可判為該受試物誘導(dǎo)了dna修復(fù)合成,具有dna損傷作用。
2.3.8.7小鼠精子畸形試驗(yàn)
2.3.8.7.1目的
以哺乳動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn),檢測(cè)受試物對(duì)雄性生殖細(xì)胞的遺傳毒性(精子形態(tài)異常)。
2.3.8.7.2試劑
(1)受試物: 常用水、植物油,或用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液。
(2)陽(yáng)性對(duì)照物:常用*或c。
(3)甲醇(優(yōu)級(jí)純)。
(4)2.5%伊紅溶液:稱取伊紅2.5g,溶于 100 ml蒸餾水中備用。
2.3.8.7.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
成年雄性小鼠*少25只,體重25g~35g。
2.3.8.7.4試驗(yàn)分組
設(shè)3個(gè)試驗(yàn)劑量組,*高劑量可取*大耐受量,或分別取1/2ld50、1/5ld50、1/20ld50。若采用一次*大*試驗(yàn),測(cè)得ld50大于5000mg/kg體重,即以5000mg/kg體重為高劑量。另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組和陰性(溶劑)對(duì)照組。每組5 只動(dòng)物。
2.3.8.7.5操作程序
(1)小鼠灌胃染毒。連續(xù) 5d,每天 1 次。
(2)**染毒后 35d,用頸椎脫臼法處死動(dòng)物,剖腹,取出附睪。
(3)將附睪放入盛有2ml生理鹽水的平皿中,用眼科剪剪碎。以3層擦鏡紙過(guò)濾,取濾液離心(1000r/min,5min)。
(4)除上清液。加入少量生理鹽水,以混懸液涂片。自然干燥。甲醇固定5min,用伊紅溶液染色1h。
(5)在高倍顯微鏡下,每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)精子中的畸形精子數(shù)。精子畸形類型可分為無(wú)鉤、香蕉形、胖頭、無(wú)定形、尾折疊、雙頭、雙尾等。分別記錄其畸變類型,以統(tǒng)計(jì)精子畸形率及精子畸形類型的構(gòu)成比。
(6)陽(yáng)性對(duì)照組,腹腔注射*(每天40mg/kg~60mg/kg體重),或c(每天1.0mg/kg~1.5mg/kg體重)。陰性對(duì)照組為受試物溶劑對(duì)照。其他操作程序同試驗(yàn)組。
2.3.8.7.6評(píng)價(jià)規(guī)定
用χ2檢驗(yàn)或其他適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與陰性(溶劑)對(duì)照組相比,精子畸形率有顯著性意義的增加,并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí);或僅一個(gè)劑量組有顯著性意義的增加,并經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)時(shí),可判為該受試物對(duì)雄性生殖細(xì)胞具有遺傳毒性。
2.3.8.8睪丸生殖細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)
2.3.8.8.1目的
利用細(xì)胞遺傳學(xué)方法,以哺乳動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)檢測(cè)受試物引起的生殖細(xì)胞染色體損傷。試驗(yàn)有小鼠精原細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)和小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn),可根據(jù)情況選做其一,或兩者均做。
2.3.8.8.2試劑
(1)受試物: 用水、植物油配成溶液,或用 0.5% 羧甲基纖維素鈉制成混懸液。
(2)陽(yáng)性對(duì)照物: 常用*,或。
(3)秋水仙素(0.04%):取40mg秋水仙素,溶于100ml 0.85% 氯化鈉溶液中,過(guò)濾**。
(4)甲醇/冰醋酸(3:1,v/v)固定液:臨用現(xiàn)配。
(5)枸掾酸三鈉。
(6)姬姆薩染液:見(jiàn)2.3.8.2.2(9)。
2.3.8.8.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選用3月~4月齡,體重25g~30g 的雄性小鼠。動(dòng)物總數(shù)不少于25 只。
2.3.8.8.4試驗(yàn)分組
受試物*少設(shè)3個(gè)試驗(yàn)劑量組,每個(gè)劑量組5只動(dòng)物。另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組和陰性(溶劑)對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組用*(40mg/kg體重)或c(1.5mg/kg~2mg/kg體重),腹腔注射。
2.3.8.8.5操作程序
(1)小鼠精原細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn),用經(jīng)口灌胃方式,共染毒兩次,間隔24h。于**次染毒后6h處死動(dòng)物。處死動(dòng)物前3.5h~5.0h腹腔注射0.04%秋水仙素溶液,劑量為4mg/kg體重。
小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn),灌胃染毒,每天1次,連續(xù)5d。于第1次染毒后的第12d~14d將受試動(dòng)物處死。處死動(dòng)物前3.5h~5.0h,腹腔注射0.04%秋水仙素溶液(4mg/kg體重)。
(2)用頸椎脫臼法處死小鼠,取睪丸,去除脂肪。置含2.2%枸櫞酸三鈉溶液平皿中去除睪丸被膜,用針頭使曲精小管松散。一個(gè)動(dòng)物的2個(gè)睪丸可分別或合并處理。
(3)用吸管盡可能去除2.2% 枸櫞酸三鈉溶液,將曲精小管置于含3ml~4ml 低滲液(1%枸櫞酸三鈉)的試管中。10min后更換低滲液,以去除碎片和精子。在室溫下,低滲時(shí)間總計(jì)不超過(guò)25min。低滲結(jié)束后去除低滲液。加入預(yù)冷的固定液(甲醇/冰醋酸),固定10min后,更換固定液,再固定10min。第3次固定*少30min,也可在冰箱中過(guò)夜。用鑷子將已固定的曲精小管移到含50%醋酸5ml的離心管中,吸管吹打*不透光,離心(1000r/min,5min)。
(4)將固定液1.0ml~1.5ml加*離心所得細(xì)胞沉淀物中。滴管吹打后,滴2 滴*用70%乙醇浸濕的玻片,分散后,熱風(fēng)干燥。
(5)用姬姆薩應(yīng)用液在室溫染色10min,自來(lái)水淋洗兩次。
(6)以油鏡檢查染色體結(jié)構(gòu)的異常情況。每只動(dòng)物做兩個(gè)睪丸,每個(gè)睪丸分析50個(gè)中期分裂相精原細(xì)胞(或精母細(xì)胞)。記錄觀察染色體型和染色單體型染色體的結(jié)構(gòu)異常。對(duì)精母細(xì)胞染色體還觀察相互易位、x-y和常染色體的單價(jià)體。
檢查染色體數(shù)目異常時(shí),記錄非整倍體和多倍體。在小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)時(shí),只有當(dāng)**次減數(shù)分裂中,四倍體生殖細(xì)胞有一個(gè)被確認(rèn)為四價(jià)體時(shí)才有意義。
2.3.8.8.6評(píng)價(jià)規(guī)定
用χ2檢驗(yàn),或其他適當(dāng)?shù)娘@著性檢驗(yàn)方法對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與陰性(溶劑)對(duì)照組相比,畸變細(xì)胞率有顯著性意義的增加,并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí);或僅一個(gè)劑量組有顯著性意義的增加,經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)后,可判為該受試物對(duì)哺乳動(dòng)物睪丸細(xì)胞具有致突變性。
2.3.9亞慢性毒性試驗(yàn)
2.3.9.1目的
(1)檢測(cè)**劑較長(zhǎng)期染毒對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性作用及其靶器官,并確定其*大未觀察到有害作用劑量。
(2)為慢性毒性和致癌試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供依據(jù)。
2.3.9.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
一般用嚙齒類動(dòng)物,優(yōu)選大鼠。所用大鼠應(yīng)為 4周~6 周齡者。全部試驗(yàn)*少需用 80 只動(dòng)物。
2.3.9.3試驗(yàn)分組
將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組(3個(gè)劑量組和1個(gè)對(duì)照組),每組20只動(dòng)物,雌雄各半。選擇受試物劑量時(shí),高劑量組應(yīng)出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng),但不引起死亡,如果出現(xiàn)動(dòng)物死亡應(yīng)不超過(guò)10%;中間劑量組應(yīng)可觀察到輕微的毒性效應(yīng);低劑量組應(yīng)不引起任何毒性效應(yīng)(屬未觀察到有害作用劑量)。*于具體的劑量選擇,可考慮高劑量為ld50的1/20~1/5,高、中、低3個(gè)劑量間的組距以3倍~5倍為宜,*低不小于2倍。另以受試物溶劑代替受試物進(jìn)行試驗(yàn),作為陰性對(duì)照組。
2.3.9.4操作程序
(1)采用灌胃方式或?qū)⑹茉囄飺饺腼暳辖?jīng)口染毒。
(2)灌胃法每天灌胃1次,每周稱體重,并按體重調(diào)整受試物給予量。如受試物摻入飼料時(shí),應(yīng)定期稱飼料消耗量,計(jì)算**劑攝入量。
(3)試驗(yàn)期為3個(gè)月(90d),末次染毒后24h檢測(cè)各項(xiàng)觀察指標(biāo),然后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,做病理學(xué)檢查。
2.3.9.5觀察指標(biāo)
觀察指標(biāo),可因**劑毒理作用不同而異,一般*少包含以下方面。
(1)臨床觀察:觀察動(dòng)物中毒表現(xiàn),每周稱量體重1次,食物消耗量*少1次~2次。
(2)血液學(xué)檢查:包括血紅蛋白含量、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞及其分類計(jì)數(shù)、血小板數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)等。
(3)血液生物化學(xué)檢查:例如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、*氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、尿素氮、肌酐、血清總蛋白和白蛋白、總*、總*等。必要時(shí),可根據(jù)所觀察到的受試物毒性效應(yīng),或與受試物化學(xué)結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)的毒性作用,選擇其他一些生化指標(biāo)。
(4)臟器重量:測(cè)量主要臟器(如肝、腎、腎上腺、睪丸等)的臟器重量和臟器系數(shù)。
(5)病理學(xué)檢查:實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),處死所有動(dòng)物,進(jìn)行系統(tǒng)解剖和肉眼觀察,并將主要器官和組織(如心、肺、肝、腎、脾、腦、腎上腺、睪丸、卵巢、胃腸和系統(tǒng)解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)的異常組織等)固定、保存。當(dāng)各劑量組動(dòng)物尸檢未發(fā)現(xiàn)明顯病變時(shí),*行高劑量組和陰性對(duì)照組動(dòng)物肝、腎、胃、腸及其它重要的和可能受損的臟器的組織病理學(xué)檢查。如發(fā)現(xiàn)病變,還應(yīng)對(duì)中、低劑量組動(dòng)物相應(yīng)的器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
2.3.9.6評(píng)價(jià)規(guī)定
將各試驗(yàn)組動(dòng)物觀察指標(biāo)與陰性對(duì)照組加以比較并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),注意各劑量組間的劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系。評(píng)定受試物*小觀察到有害作用劑量和*大未觀察到有害作用劑量及毒性作用的靶器官。
2.3.10致畸胎試驗(yàn)
2.3.10.1目的
檢測(cè)**劑對(duì)妊娠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有無(wú)致畸胎性,確定其未觀察到發(fā)育毒性的劑量。
2.3.10.2試劑
(1)1/1000茜素紅溶液:茜素紅0.1g,氫氧化鉀10g,加蒸餾水1000m1。
(2)透明液a:甘油200ml,氫氧化鉀10g,蒸餾水790ml。
(3)透明液b:甘油與蒸餾水等量混合。
(4)固定液(bouins液):飽和液75份,甲醛20份,冰醋酸5份。
2.3.10.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
試驗(yàn)用大鼠或小鼠(必要時(shí)可用家兔)。用大鼠和小鼠試驗(yàn)時(shí),取健康、性成熟、未交配過(guò)的體重為200g~250g的大鼠,或體重為25g~30g的小鼠。
2.3.10.4試驗(yàn)分組
*少設(shè)4組,其中3個(gè)為試驗(yàn)組,1個(gè)為陰性對(duì)照組。每組*少有15只孕鼠。高劑量組可用雌鼠的1/10ld50作為試驗(yàn)劑量;低劑量組,可用雌性動(dòng)物的1/100ld50作為試驗(yàn)劑量。其間設(shè)中劑量組。陰性對(duì)照組以受試物的溶劑代替受試物進(jìn)行試驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照組常用*(300mg/kg體重)、敵枯雙(1mg/kg體重)或*(40000iu)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室**進(jìn)行的種或品系必需設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。為了保證試驗(yàn)方法的可靠性,每隔半年需用陽(yáng)性對(duì)照物檢查一次。
2.3.10.5操作程序
(1)將雌鼠和雄鼠按 1:1 或 2:1的比例同籠飼養(yǎng)。每日晨觀察陰栓(或**涂片)。查出陰栓或精子的當(dāng)天定為孕期零天。如5d內(nèi)未交配,調(diào)換雌鼠。查出的孕鼠按上述隨機(jī)分組,并進(jìn)行稱重和編號(hào)。
(2)在大、小鼠孕期6d~15d期間,每天用灌胃法給予受試物。分別于孕期0d、6d、10d、15d和20d稱重孕鼠,并根據(jù)體重調(diào)整受試物給予量。注意觀察并記錄孕鼠的毒性反應(yīng)。
(3)大鼠于孕期第20d,小鼠于孕期第18d,用頸椎脫臼法處死。剖腹,取出**稱重,檢查活胎、吸收胎、早期死胎和晚期死胎數(shù)。
(4)逐個(gè)記錄活胎鼠的性別、體重、身長(zhǎng)和尾長(zhǎng)。外觀檢查頭面部、軀干部、四肢等有無(wú)畸形,諸如皮下出血、露腦、腦膨出、眼部畸形(無(wú)眼或開(kāi)眼等)、鼻孔擴(kuò)大、單鼻孔、唇裂、脊柱裂、四肢和尾畸形、**閉鎖等。
(5)每窩取約1/2~2/3活胎鼠,用*剝皮。取出內(nèi)臟(注意勿拉斷肋骨),去掉后頸和兩肩胛骨之間的脂肪塊。將胎鼠放入茜素紅溶液染色。當(dāng)天搖動(dòng)玻璃瓶2次~3次。待骨骼染成紅色時(shí)為止。將胎鼠換入透明液a中1d~2d,換入透明液b中2d~3d。待胎鼠骨骼已染紅,而軟組織的紫紅色基本褪去,可換置甘油中。
(6)將染好的標(biāo)本連同甘油一并倒入含水平皿內(nèi),在解剖顯微鏡下,用透射光源,先觀察胎鼠全身,然后逐步檢查:①頭骨、胸骨、脊椎骨、肋骨和四肢等有無(wú)骨化不全、骨化遲緩和其他缺陷。②觀察脊椎骨有無(wú)缺失、融合、縱裂等畸形;③觀察胸骨的發(fā)育和數(shù)目,有無(wú)胸骨缺失等;④檢查肋骨有無(wú)融合肋、分叉肋、肋骨中斷、缺肋、短肋、波狀肋、多肋畸形等;⑤*后檢查四肢骨畸形。
(7)每窩取約 1/3~1/2 活胎鼠浸入固定液2周,作內(nèi)臟檢查。將已固定的胎鼠用水沖凈,仰放于石蠟板上。剪去四肢和尾,用刀片在頭頸部常規(guī)共切4刀,再用剪刀剖開(kāi)胸、腹腔。著重檢查:①有無(wú)裂舌、雙叉舌、裂腭及眼、鼻和腦部的畸形;②是否出現(xiàn)右位心、心臟過(guò)大、肺過(guò)大或過(guò)小等畸形;③消化系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)各器官的大小、形狀以及位置;④ 有無(wú)腎盂積水,雙側(cè)有無(wú)睪丸,以及**發(fā)育不全等畸形。
2.3.10.6評(píng)價(jià)規(guī)定
主要觀察動(dòng)物畸胎出現(xiàn)率,同時(shí)觀察其他指標(biāo),如著床數(shù)、活胎數(shù)、晚期死胎數(shù)、早期死亡數(shù),以及活胎體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)等。
觀察全部結(jié)果的劑量-反應(yīng)關(guān)系,確定受試物的母體毒性、發(fā)育毒性及致畸性。求出受試物的*小致畸劑量和*大無(wú)致畸作用劑量。對(duì)致畸強(qiáng)度應(yīng)以致畸指數(shù)表示。
致畸指數(shù)= (雌鼠ld50)/(*小致畸劑量)
致畸指數(shù)小于或等于10為基本不致畸;大于10*100為致畸;大于100為強(qiáng)致畸。
2.3.11慢性毒性試驗(yàn)
2.3.11.1目的
檢測(cè)受試物長(zhǎng)期染毒對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所產(chǎn)生的毒性作用,確定其*小觀察到有害作用劑量,*大未觀察到有害作用劑量及毒性作用的靶器官。
2.3.11.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
試驗(yàn)選用剛離乳的大鼠。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí),每個(gè)劑量組每種性別的動(dòng)物應(yīng)不少于10只。中間需活殺動(dòng)物檢查時(shí),需相應(yīng)增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量。
2.3.11.3試驗(yàn)分組
將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分在3個(gè)劑量組和1個(gè)陰性對(duì)照組。陰性對(duì)照組除不接觸**劑外,其它與實(shí)驗(yàn)組相同,若在試驗(yàn)中對(duì)受試物使用溶劑或賦形劑時(shí),陰性對(duì)照組應(yīng)給予相應(yīng)劑量的溶劑或賦形劑。試驗(yàn)劑量根據(jù)亞慢性試驗(yàn)結(jié)果選擇。高劑量應(yīng)引起明顯的毒性效應(yīng)甚*個(gè)別動(dòng)物死亡,低劑量應(yīng)不引起毒性效應(yīng)。
2.3.11.4操作程序
(1)用灌胃法或?qū)⑹茉囄飺饺腼暳匣蝻嬎形癸?。摻入飼料的受?*劑的*高濃度一般不超過(guò)5%。飼料中受試**劑應(yīng)定期監(jiān)測(cè),觀察其均勻性和穩(wěn)定性。
(2)灌胃法每天給藥一次。
(3)前3個(gè)月每周稱量體重,3個(gè)月后每月稱1次體重,調(diào)整受試物灌胃量。如受試物摻入飼料,應(yīng)定期稱飼料消耗量。如受試物溶于飲水中喂飼,需記錄動(dòng)物的飲水量。
(4)試驗(yàn)期限為一般為6個(gè)月,必要時(shí)可延長(zhǎng)*2 年。
2.3.11.5觀察指標(biāo)
指標(biāo)與亞慢性毒性試驗(yàn)基本相同,也可根據(jù)受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的亞慢性毒性作用和靶器官,可適當(dāng)增加或更換一些針對(duì)性更強(qiáng)更靈敏的觀察指標(biāo)。
(1)臨床觀察:觀察中毒表現(xiàn),體重前3個(gè)月每周1次,以后每月1次。
(2)血液學(xué)檢查:于試驗(yàn)的第3個(gè)月、6個(gè)月及以后每半年進(jìn)行1次血液學(xué)檢查。
(3)血液生化檢查:檢查時(shí)間同血液學(xué)檢查。
(4)病理學(xué)檢查:
系統(tǒng)解剖:所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括試驗(yàn)過(guò)程中死亡的動(dòng)物都應(yīng)進(jìn)行完整的系統(tǒng)解剖和詳盡的肉眼觀察。肉眼可見(jiàn)的異常組織都應(yīng)留樣作進(jìn)一步組織病理學(xué)檢查。
臟器重量:稱取腦、肝、腎、腎上腺和睪丸重量并計(jì)算臟器系數(shù)。
組織學(xué)檢查:對(duì)照組、高劑量組動(dòng)物及系統(tǒng)解剖發(fā)現(xiàn)異常的組織均需作詳盡的組織學(xué)檢查。當(dāng)高劑量組有異常發(fā)現(xiàn)時(shí),其它劑量組才進(jìn)行相應(yīng)檢查。檢查臟器一般包括腦、心、肺、肝、脾、腎、胃、腸、腎上腺、甲狀腺、垂體、睪丸(卵巢)和**等。
2.3.11.6評(píng)價(jià)規(guī)定
比較各劑量組與對(duì)照組觀察指標(biāo)的變化。計(jì)算分析其劑量-反應(yīng)關(guān)系,并確定受試物*小觀察到有害劑量和*大未觀察到有害作用劑量,及毒性作用靶器官。
2.3.12致癌試驗(yàn)
2.3.12.1目的
檢測(cè)長(zhǎng)期接觸**劑后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)腫瘤的情況,評(píng)價(jià)其致癌性。也可將致癌試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)結(jié)合在一批動(dòng)物中進(jìn)行。
2.3.12.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
以剛離乳的大鼠或小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。如與慢性毒性試驗(yàn)結(jié)合進(jìn)行,通常選用大鼠。各劑量組和陰性對(duì)照組使用的有效動(dòng)物數(shù),*少雌雄各50只。如與慢性毒性結(jié)合進(jìn)行,試驗(yàn)中間需處死動(dòng)物進(jìn)行檢查時(shí),需相應(yīng)增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)。
2.3.12.3試驗(yàn)分組
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組同慢性試驗(yàn),一般設(shè)3個(gè)劑量組與1個(gè)陰性對(duì)照組(見(jiàn)2.3.11.3)。根據(jù)亞慢性試驗(yàn)結(jié)果選擇劑量。*高劑量組為*大耐受劑量,可引起輕度毒性效應(yīng),但不能因腫瘤以外因素明顯縮短其生命期限。*低劑量組應(yīng)不影響動(dòng)物正常的生長(zhǎng)、發(fā)育和壽命,即不引起任何毒性效應(yīng)。中間劑量處于*高和*低劑量之間。若在試驗(yàn)中對(duì)受試物使用溶劑或賦形劑時(shí),陰性對(duì)照組應(yīng)以相應(yīng)的溶劑或賦形劑進(jìn)行試驗(yàn)。
2.3.12.4操作程序
(1)將受試物灌胃或摻入飼料或飲水中喂飼。摻入飼料中的受試物*高濃度,不應(yīng)超過(guò) 5%。如用灌胃法,每天給藥1次。
(2)前3個(gè)月每周稱體重,3個(gè)月后每月稱體重,并調(diào)整受試物的灌胃量。每周稱飼料消耗量1次。若受試物溶于飲水中喂飼,需記錄飲水量。試驗(yàn)期應(yīng)包括動(dòng)物正常壽命期的大部分時(shí)間,大鼠為2年以上,小鼠為18個(gè)月以上。
(3)試驗(yàn)過(guò)程中,除觀察一般臨床癥狀外著重觀察動(dòng)物的腫瘤發(fā)生情況。對(duì)每一肉眼可見(jiàn)或可觸及的腫瘤,其出現(xiàn)的時(shí)間、部位、大小、外形和發(fā)展情況均應(yīng)有記錄。
(4)凡在試驗(yàn)過(guò)程中死亡或?yàn)l死而提前處死,以及試驗(yàn)結(jié)束全部處死的動(dòng)物,均應(yīng)進(jìn)行完整的尸檢及系統(tǒng)的、**的、詳細(xì)的器官和組織的病理學(xué)檢查。對(duì)肉眼可見(jiàn)腫瘤或可疑病變組織,對(duì)試驗(yàn)過(guò)程中死亡或?yàn)l死而提前處死的動(dòng)物,高劑量組和對(duì)照組的全部動(dòng)物,均需進(jìn)行**的病理組織學(xué)檢查。如果高劑量組腫瘤、癌前病變或增生的發(fā)生率和陰性對(duì)照組者相比,差別有顯著性時(shí),則中、低劑量組所有動(dòng)物的有關(guān)器官和組織均需進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。若高劑量組存活動(dòng)物數(shù)顯著少于對(duì)照組或存在影響腫瘤發(fā)生的毒作用時(shí),則中劑量組也應(yīng)按上述高劑量組的要求進(jìn)行系統(tǒng)檢查。
(5)若致癌試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)結(jié)合一起進(jìn)行,還應(yīng)按慢性毒性試驗(yàn)的要求,對(duì)有關(guān)指標(biāo)進(jìn)行觀察和記錄。
2.3.12.5評(píng)價(jià)規(guī)定
(1)腫瘤發(fā)生率:腫瘤發(fā)生率是整個(gè)實(shí)驗(yàn)終了時(shí),患瘤動(dòng)物總數(shù)在有效動(dòng)物總數(shù)中所占的百分率,有效動(dòng)物總數(shù)是指*早出現(xiàn)腫瘤時(shí)的存活動(dòng)物總數(shù)。
實(shí)驗(yàn)終了時(shí)患瘤動(dòng)物總數(shù)
腫瘤發(fā)生率=×100%
有效動(dòng)物總數(shù)
(2)致癌試驗(yàn)陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn):按世界衛(wèi)生組織(who,1969)提出的下列 4條致癌試驗(yàn)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
1)陰性對(duì)照組動(dòng)物出現(xiàn)的一種或數(shù)種腫瘤,試驗(yàn)組均有發(fā)生且發(fā)生率超過(guò)前者。
2)試驗(yàn)組發(fā)生陰性對(duì)照組未有的腫瘤。
3)試驗(yàn)組腫瘤發(fā)生的時(shí)間早于陰性對(duì)照組者。
4)試驗(yàn)組每個(gè)動(dòng)物的平均腫瘤數(shù)超過(guò)陰性對(duì)照組者。
(3)致癌試驗(yàn)陰性結(jié)果的確立
假如動(dòng)物試驗(yàn)規(guī)模為兩種種屬、兩種性別,*少3個(gè)劑量,其中一個(gè)接近*大耐受劑量,每組動(dòng)物*少50只,實(shí)驗(yàn)組腫瘤發(fā)生率與對(duì)照組無(wú)差異。
(4)試驗(yàn)報(bào)告:在結(jié)果報(bào)告中,應(yīng)寫(xiě)明所發(fā)現(xiàn)腫瘤的部位、數(shù)量、性質(zhì)、癌前病變,其它毒性效應(yīng),以及劑量-反應(yīng)關(guān)系及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。
2.3.13毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果的*終判定
2.3.13.1 **階段試驗(yàn)結(jié)果的判定
(1)在急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)中,ld50>5000mg/kg體重,可通過(guò);對(duì)于稀釋使用的**劑,當(dāng)ld50≤5000mg/kg體重時(shí),則需增做**劑*高應(yīng)用濃度5倍的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。增做的試驗(yàn)結(jié)果,如果ld50>5000mg/kg體重,可通過(guò);否則,應(yīng)增做**劑原形樣品的亞慢性毒性試驗(yàn)。
(2)在急性吸入毒性試驗(yàn)中,lc50>10000mg/m3者,屬于實(shí)際無(wú)毒,可通過(guò);否則,應(yīng)放棄使用。
(3)在皮膚刺激試驗(yàn)中,如結(jié)果為無(wú)刺激或僅具輕度刺激作用,可通過(guò);否則,應(yīng)放棄使用。
(4)在急性眼刺激試驗(yàn)中,如結(jié)果對(duì)眼無(wú)刺激性或具有輕刺激性,可通過(guò);否則,應(yīng)放棄使用。
(5)在**黏膜刺激試驗(yàn)中,如結(jié)果對(duì)**黏膜無(wú)刺激性或極輕度刺激性,可通過(guò);否則,應(yīng)放棄使用。
(6)在皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)中,如**劑對(duì)皮膚僅具有極輕度的致敏作用,可通過(guò);否則,應(yīng)放棄使用。
2.3.13.2**階段試驗(yàn)結(jié)果的判定
(1)在亞急性毒性試驗(yàn)中,如各劑量組均未觀察到毒作用,可通過(guò);否則,根據(jù)試驗(yàn)的*小觀察到有害作用劑量或*大未觀察到有害作用劑量(以mg/kg計(jì)),再參考**劑的毒理作用特點(diǎn)和使用條件,由專家評(píng)定。
(2)致突變?cè)囼?yàn)結(jié)果的判定
對(duì)**類**劑所進(jìn)行的分別反映基因水平、體細(xì)胞染色體水平和性細(xì)胞染色體水平的3種類型致突變?cè)囼?yàn)中,如有2種或3種類型試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性,該**劑應(yīng)放棄,不必繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。如果僅一種類型試驗(yàn)為陽(yáng)性,應(yīng)再增做另一項(xiàng)同類型致突變?cè)囼?yàn)。若其結(jié)果仍為陽(yáng)性,該**劑亦應(yīng)放棄使用。
對(duì)**類**劑所進(jìn)行的分別反映基因水平和染色體水平類型的兩項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)中,如均為陽(yáng)性,該**劑應(yīng)放棄使用,不必繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。若僅一種類型試驗(yàn)為陽(yáng)性,應(yīng)再增做另一項(xiàng)同類型致突變?cè)囼?yàn),如結(jié)果為陰性,可通過(guò);否則需進(jìn)入第三階段或第四階段試驗(yàn)。
對(duì)第三類**劑所進(jìn)行的反映基因水平或體細(xì)胞染色體水平類型一項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)中,如結(jié)果為陰性,可通過(guò);如結(jié)果呈陽(yáng)性,應(yīng)再增補(bǔ)另一種類型的一項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn),若仍為陽(yáng)性,該**劑應(yīng)放棄使用。
2.3.13.3 第三階段試驗(yàn)結(jié)果的判定
根據(jù)亞慢性毒性試驗(yàn)和致畸胎試驗(yàn)中的*小觀察到有害作用劑量或*大未觀察到有害作用劑量(以mg/kg體重計(jì)),再參考**劑的毒理作用特點(diǎn)和使用條件,由專家評(píng)定。
2.3.13.4 第四階段試驗(yàn)結(jié)果的判定
根據(jù)慢性試驗(yàn)中的*小觀察到有害作用劑量或*大未觀察到有害作用劑量(以mg/kg計(jì)),或在任何一個(gè)劑量組發(fā)現(xiàn)有致癌作用,均需由有關(guān)專家評(píng)議作出結(jié)論。
2.3.13.5以上各項(xiàng)為**劑安全性毒理學(xué)評(píng)定的基本原則。對(duì)特殊情況,應(yīng)由有關(guān)專家評(píng)議作出結(jié)論。