實(shí)驗(yàn)方法原理大多mdr細(xì)胞膜上出現(xiàn)mdr-1基因及其基因產(chǎn)物p-糖蛋白過(guò)度表達(dá)。 多藥抗藥基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄和pcr的方法來(lái)檢測(cè)這些特定基因的過(guò)度表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)材料rna
試劑、試劑盒pbs lu仿 異丙醇 萘酸 異硫氰酸肽 十二烷基肌酸鈉 構(gòu)櫞酸鈉 乙酸鈉 二疏基乙醇 乙醇 taq酶
儀器、耗材離心機(jī) 紫外分光光度計(jì) 瓊脂糖凝膠電泳 pcr儀
實(shí)驗(yàn)步驟一、細(xì)胞總rna提取
1. 收集約5x107個(gè)細(xì)胞，冷pbs洗滌。
2. 加入400 ul rna提取液（含6 mol/l 的異硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸鈉，0.025 mol/l 構(gòu)櫞酸鈉ph7.0，0.25 mol/l 乙酸鈉，ph4.0，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸），混勻。
3. 加入400 ul lu仿，混勻，以13 000 r/min 于4℃離心15 min。
4. 取上清液加入等體積的異丙醇，4℃放置30 min。
5. 然后以13 000 r/min 離心15 min，吸上清，將rna成點(diǎn)用75%的乙醇洗滌1次，溶于100 ul 的無(wú)菌雙蒸餾水中。
6. 并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)rna純度（a260/a280應(yīng)為1.8~2.0）后備用。
二、反轉(zhuǎn)錄及pcr擴(kuò)增
1. 引物
2. 取細(xì)胞總rna10 ul 加入20 ul amv逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系中，42℃保溫30 min 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cdna。
3. 然后置95℃，3 min 終止反轉(zhuǎn)錄。
4. 接著在taq酶的作用下，用mdr-1和β2-mg引物，對(duì)cdna上的目的片段進(jìn)行pcr
5. 94℃預(yù)變性2 min，然后94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。
6. 終在60℃保溫7 min，以保證產(chǎn)物充分延伸。
7. 取10 ul 擴(kuò)增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下照相，與mdr-1 cdna陽(yáng)性對(duì)照，等位的dna條帶為陽(yáng)性，反之為陰性。
注意事項(xiàng)1. 盡可能在低溫下操作；
2. 適量斟酌trizon等的用量；
3. 在每一次離心后除盡蛋白質(zhì)、不溶物提取操作時(shí)必須戴手套、口罩等防止dna酶的影響；
4. 注意trizon帶有腐蝕性；
5. 重要的就是防止dnase的污染，手套、口罩*，所用的槍頭和ep管等也要rna提取的，無(wú)dna酶的。