結(jié)晶紫染色液和革蘭氏染色的實(shí)驗(yàn)原理與操作步驟！
革蘭氏染色是一項(xiàng)經(jīng)典的細(xì)菌鑒別手段，自19世紀(jì)80年代丹麥的醫(yī)師gram創(chuàng)立起，至今已經(jīng)近一個(gè)半世紀(jì)，仍舊在細(xì)菌的檢測(cè)和鑒定分類(lèi)上被廣泛應(yīng)用著。在我國(guó)，gb 4789系列的國(guó)標(biāo)中很多致病菌的檢測(cè)也都需要進(jìn)行革蘭氏染色，可見(jiàn)其重要性。
一、革蘭氏染色的原理
細(xì)菌細(xì)胞通過(guò)結(jié)晶紫染色液初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類(lèi)脂，故乙醇處理不會(huì)出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類(lèi)脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類(lèi)脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過(guò)乙醇脫色后仍呈無(wú)色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。
二、革蘭氏染色的步驟
涂片、晾干、固定、染色、水洗、媒染、脫色、復(fù)染。
三、影響革蘭氏染色結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素
1、試劑影響。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)建立有效的試劑管理程序，從試劑的驗(yàn)收到存放、使用、過(guò)期后的廢棄處理都應(yīng)有嚴(yán)格規(guī)定，確保我們使用的試劑是有效的。
2、染色菌的選擇。菌齡對(duì)革蘭氏染色結(jié)果的影響是十分大的。我們?nèi)旧^(guò)程中選擇的菌應(yīng)該是處于活躍生長(zhǎng)期，這樣的細(xì)菌活性強(qiáng)，生理特征明顯，所以染色的結(jié)果準(zhǔn)確度高，一般情況下不會(huì)出現(xiàn)誤差。培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的革蘭氏陽(yáng)性菌，由于細(xì)胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已經(jīng)死亡或者自行溶解了，造成細(xì)胞壁通透性增加，就會(huì)呈現(xiàn)出假陰性。
3、涂菌的狀態(tài)。在染色最初的涂布中，在挑取菌體后應(yīng)該在無(wú)菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布過(guò)程中，若是菌體堆積，也會(huì)極大影響染色結(jié)果的準(zhǔn)確性。菌落堆積過(guò)多，往往菌體之間變得毫無(wú)縫隙，而其細(xì)胞壁的成分影響造成了脫色的情況不佳，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。同時(shí)，在初染、媒染及復(fù)染的過(guò)程中，應(yīng)將染液覆蓋整個(gè)菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒(méi)有染色。因此在涂片過(guò)程一定要將菌膜涂得少而均勻，這樣才能達(dá)到效果。
4、媒染時(shí)間。媒染時(shí)間對(duì)革蘭氏陰性菌的染色結(jié)果有很大影響。由于媒染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，結(jié)晶紫在碘液長(zhǎng)時(shí)間作用下過(guò)分牢固結(jié)合在菌體細(xì)胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會(huì)導(dǎo)致這種假陽(yáng)性的效果。
5、酒精脫色。酒精脫色也是一個(gè)對(duì)結(jié)果影響較大的操作過(guò)程。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌最主要的差異是細(xì)胞壁肽聚糖層厚度和結(jié)構(gòu)，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖層很薄，脂多糖含量高因此在酒精脫色時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞壁的多糖成分會(huì)被酒精溶解，增大了細(xì)胞壁的通透性，結(jié)晶紫及碘復(fù)合物就很快被酒精洗脫，之后就會(huì)被沙黃復(fù)染呈紅色；而陽(yáng)性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精只能起到脫水效果而無(wú)法進(jìn)入，這樣結(jié)晶紫和復(fù)合物就無(wú)法洗脫出來(lái)使細(xì)胞呈紫色。因此，酒精脫色時(shí)間短，脫色效果不佳，會(huì)導(dǎo)致陰性菌菌體內(nèi)的結(jié)晶紫和復(fù)合物不能有效的全部洗脫出來(lái)，就會(huì)出現(xiàn)明顯的誤差，使陰性菌出現(xiàn)假陽(yáng)性。而洗脫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁被酒精破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的紫色被洗脫，呈現(xiàn)假陰性。因此洗脫時(shí)間也是革蘭氏染色的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。洗脫時(shí)間應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制在20s-30s之間，同時(shí)保證洗脫效果。
總而言之，在整個(gè)革蘭氏染色過(guò)程中，在保證試劑有效的前提下，需要嚴(yán)格控制的幾個(gè)方面：染色菌必須是在其活躍期內(nèi)，涂布狀態(tài)不可太厚，媒染時(shí)間嚴(yán)格控制在50s-60s之間，脫色時(shí)間嚴(yán)格控制在20s-30s。