背景
細(xì)菌培養(yǎng)基的光密度（od）測(cè)定是微生物學(xué)中使用的一種常見技術(shù)。研究人員主要依靠分光光度計(jì)來進(jìn)行這些測(cè)定，然而實(shí)際上這個(gè)測(cè)定是基于培養(yǎng)基的光散射量而不是光吸收量。在其標(biāo)準(zhǔn)配置中，分光光度計(jì)并未對(duì)光散射測(cè)定進(jìn)行優(yōu)化，這通常會(huì)導(dǎo)致儀器間所測(cè)得吸光度上的差異。
方法
該研究調(diào)查了不同的分光光度計(jì)光學(xué)配置對(duì)在分批培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌jm109光密度測(cè)定的影響。分光光度計(jì)檢測(cè)包括了使用陣列檢測(cè)的反向光學(xué)系統(tǒng)、基于單色器的傳統(tǒng)系統(tǒng)以及一種配備積分球配件（isa）的單色器系統(tǒng)。在每個(gè)儀器上測(cè)定od600生長曲線，同時(shí)，對(duì)mcfarland進(jìn)行cfu/ml計(jì)數(shù)來進(jìn)一步對(duì)每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。
結(jié)果
來自相同光學(xué)配置類別的分光光度計(jì)其od數(shù)據(jù)是相當(dāng)?shù)?。用反向光學(xué)系統(tǒng)測(cè)定較高od時(shí)數(shù)據(jù)變化更大，這是由較低雜散光所導(dǎo)致。基于單色器的系統(tǒng)測(cè)試較高od時(shí)準(zhǔn)確度較高，主要是因?yàn)榕c來自反向光學(xué)系統(tǒng)的多色光相比，單色光具有更好的雜散光去除能力。然而，反向光學(xué)系統(tǒng)測(cè)定od時(shí)卻有具有良好的動(dòng)態(tài)范圍。使用isa產(chǎn)生出的數(shù)據(jù)與用其它系統(tǒng)產(chǎn)生出的數(shù)據(jù)不同，這是因?yàn)槠渚哂胁蹲綆缀跛星跋蛏⑸涔獾哪芰?。而?duì)mcfarland標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定確認(rèn)了這些現(xiàn)象。
結(jié)論
分光光度計(jì)進(jìn)行可靠的光散射測(cè)定的能力在很大程度上取決于其光學(xué)配置；因此，具有不同光學(xué)配置的分光光度計(jì)會(huì)呈現(xiàn)出不同的od測(cè)定值。理想狀態(tài)下，高度散射樣品（如細(xì)胞培養(yǎng)基）的吸光度是使用isa進(jìn)行測(cè)定的，目的是為了捕捉幾乎所有的散射光。培養(yǎng)基生長可使用od600測(cè)定，然而每當(dāng)改變分光光度計(jì)時(shí)，就應(yīng)該計(jì)算和應(yīng)用一個(gè)換算因數(shù)。
引言
培養(yǎng)基中細(xì)菌生長（遲緩期、對(duì)數(shù)生*、穩(wěn)定生長期和衰亡期）各個(gè)階段都能記錄下來，其中對(duì)數(shù)期被認(rèn)為是細(xì)菌分裂zui快的階段（1）。使用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)基在600nm（od600）時(shí)的光密度，從而監(jiān)控細(xì)菌生長一直是微生物學(xué)中的一種核心技術(shù)。使用細(xì)菌od600的三種更為常見的應(yīng)用如下：（a）在細(xì)菌表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，找到誘導(dǎo)蛋白的*時(shí)間，（b）用于zui小抑菌濃度（mic）實(shí)驗(yàn)的接種體濃度的確定和標(biāo)準(zhǔn)化，和（c）收獲和制備感受態(tài)細(xì)胞的zui佳時(shí)間的確定。研究人員繼續(xù)依靠分光光度計(jì)進(jìn)行這些od測(cè)定。然而，光密度不是一個(gè)吸光度指標(biāo)，而是細(xì)菌混懸液的一種光散射指標(biāo)，將其自身作為吸光度顯示（圖1）。分光光度計(jì)光學(xué)配置對(duì)光密度測(cè)定的影響得到了很好的記錄（2-4）。具有不同光學(xué)配置的儀器對(duì)同一細(xì)菌混懸液測(cè)定得到了不同的光密度。分光光度計(jì)光學(xué)配置上的差異對(duì)觀察到的差異影響zui大。前向光學(xué)系統(tǒng)采用單色光來進(jìn)行吸光度的測(cè)定，而反向光學(xué)系統(tǒng)則利用多色輻射進(jìn)行測(cè)定，光在其穿過樣品后再區(qū)分成單獨(dú)波長（圖2）。前向光學(xué)系統(tǒng)的一些要素導(dǎo)致了測(cè)得od值上的差異：（a）樣品與檢測(cè)器之間的距離，（b）聚光透鏡的尺寸和焦距大小不同，和（c）檢測(cè)器的面積和靈敏度（5）。盡管現(xiàn)在都知道不同的光學(xué)配置會(huì)產(chǎn)生不同的od值，但是研究人員仍繼續(xù)關(guān)注在不同分光光度計(jì)間發(fā)現(xiàn)的od值差異。在本研究中，我們分析了多種光學(xué)配置分光光度計(jì)測(cè)出的od值差異。我們?cè)诜峙囵B(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌jm109，并監(jiān)控od達(dá)9.5小時(shí)。在測(cè)定之前稀釋培養(yǎng)基，并將由于不同分光光度計(jì)光學(xué)元件差異造成的不同od值進(jìn)行換算。
儀器
光學(xué)系統(tǒng)
光學(xué)幾何學(xué)
光源
檢測(cè)器
evolution array
反向光學(xué)
氘和鎢燈
光電二極管陣列
nanodrop 2000c
反向光學(xué)
氙燈
cmos陣列
spectronic 200
反向光學(xué)
鎢燈
ccd陣列
evolution 260 bio
前向光學(xué)
前向光學(xué)
氙燈
硅光電二極管
evolution 300
前向光學(xué)
前向光學(xué)
氙燈
硅光電二極管
biomate 3s
前向光學(xué)
雙光束
氙燈
硅光電二極管
結(jié)果
從未稀釋和稀釋的培養(yǎng)基中收集的od600數(shù)據(jù)如圖3所示。將來自稀釋溶液的od600值乘以稀釋因數(shù)，并與未稀釋的樣品進(jìn)行對(duì)比。兩張圖的分歧表明，不同的光學(xué)配置在光密度測(cè)定方面會(huì)有不同的動(dòng)態(tài)范圍。當(dāng)對(duì)比每個(gè)分光光度計(jì)的校正od值與細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，具有相似光學(xué)系統(tǒng)的儀器產(chǎn)生了相似的od曲線（圖4）。具有前向光學(xué)系統(tǒng)，但卻是雙光束光學(xué)幾何結(jié)構(gòu)的biomate 3s，與儀器組的差異zui大。mcfarland數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出一種與大腸桿菌生長相似的曲線（圖5）。isa使用mcfarland標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生了更低的光密度（圖6）。
圖1結(jié)論
·計(jì)算od測(cè)定值時(shí)，確定您所用分光光度計(jì)的光密度性能和動(dòng)態(tài)范圍是至關(guān)重要的。為獲得有關(guān)生長曲線的zui準(zhǔn)確信息，稀釋細(xì)胞混懸液是很重要的。
·od測(cè)定在很大程度上取決于光學(xué)系統(tǒng)和幾何學(xué)。對(duì)于相同的混懸液，具有不同光學(xué)系統(tǒng)和配置的分光光度計(jì)會(huì)讀出不同的od值。例如，在反向光學(xué)系統(tǒng)evolution array和前向光學(xué)系統(tǒng)，雙光束biomate 3s之間有實(shí)質(zhì)性的分歧。
·積分球配件（isa）可捕捉幾乎所有的前向散射光，從而產(chǎn)生了更低的光密度。這是因?yàn)橥ǔ？雌饋肀?br>樣品吸收的散射光實(shí)際上是被isa配件所收集。isa對(duì)測(cè)定高度散射溶液中分析成分的吸光度是理想之選；然而，在測(cè)定細(xì)胞混懸液的光密度時(shí)，其是無效的。
·zui后，我們提出了如何計(jì)算一個(gè)可用于使od數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以便能在不同分光光度計(jì)間進(jìn)行適當(dāng)比較的換算因數(shù)。值得注意的是，這個(gè)換算因數(shù)是針對(duì)一種特定的有機(jī)體，因?yàn)槲⒘５某叽绾托螤顣?huì)影響換算因數(shù)。
分光光度法中的光散射
致。
b 在一個(gè)散射樣品中（如一種細(xì)菌混懸液），到達(dá)檢測(cè)器的光會(huì)因光散射而進(jìn)一步減少。到達(dá)檢測(cè)
器光的減少造成了樣品吸光度增
長的錯(cuò)覺。
圖2前向和反向光學(xué)系統(tǒng)之間的差
異
在前向光學(xué)系統(tǒng)中