液相色譜(hplc)法是以高壓下的液體為流動(dòng)相，并采用顆粒極細(xì)的固定相的柱色譜分離技術(shù)。液相色譜對(duì)樣品的適用性廣，不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用液相色譜來分析。
液相色譜和氣相色譜在基本理論方面沒有顯著不同，它們之間的重大差別在于作為流動(dòng)相的液體與氣體之間的性質(zhì)的差別。
液相色譜分析原理
(1)、液相色譜分析的流程：由泵將儲(chǔ)液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測(cè)量之后，導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測(cè)物由進(jìn)樣器注入，并隨流動(dòng)相通過色譜柱，在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)信號(hào)由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離(極性范圍比較寬)還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而hplc改變的是流動(dòng)相極性，使樣品各組分在佳條件下得以分離。
(2)、液相色譜的分離過程：同其他色譜過程一樣，hplc也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。
開始樣品加在柱頭上，假設(shè)樣品中含有3個(gè)組分，a、b和c，隨流動(dòng)相一起進(jìn)入色譜柱，開始在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。分配系數(shù)小的組分a不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分c在固定相上滯留時(shí)間長(zhǎng)，較晚流出色譜柱。組分b的分配系數(shù)介于a，c之間，第二個(gè)流出色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達(dá)到分離之目的。
不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問題，也是分離的首要條件。其次，當(dāng)不同組分在色譜柱中運(yùn)動(dòng)時(shí)，譜帶隨柱長(zhǎng)展寬，分離情況與兩相之間的擴(kuò)散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動(dòng)相的流速等有關(guān)。所以分離終效果則是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的綜合效益。
工作原理
儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相,被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相) 內(nèi), 由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù), 在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí), 經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過程,各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別, 被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出, 通過檢測(cè)器時(shí), 樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。
hplc的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)
hplc有以下特點(diǎn)：
高壓——壓力可達(dá)150~300 kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。
高速——流速為0.1~10.0 ml/min。
——可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。
高靈敏度——紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。
hplc與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：
速度快——通常分析一個(gè)樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。
分辨率高——可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到佳分離效果。
靈敏度高——紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。
柱子可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
液相色譜的五大系統(tǒng)
1、進(jìn)樣系統(tǒng)
進(jìn)樣系統(tǒng)分為手動(dòng)進(jìn)樣閥和自動(dòng)進(jìn)樣器。
手動(dòng)進(jìn)樣閥
對(duì)于手動(dòng)進(jìn)樣閥使用過程中需要注意每個(gè)樣品進(jìn)樣完成后應(yīng)對(duì)進(jìn)樣閥進(jìn)行清洗，防止殘留對(duì)下一個(gè)樣品分析的影響。還需要注意進(jìn)樣方式，以20μl定量環(huán)為例，我們可以選擇*充滿定量管或部分充滿定量管。為了保證進(jìn)樣的重復(fù)性，選擇*充滿定量管進(jìn)樣方式時(shí)，需要注入定量環(huán)體積3倍以上的樣品;選擇部分充滿定量管進(jìn)樣方式時(shí)，進(jìn)樣體積應(yīng)在定量管體積一半以下，即1-10μl。
自動(dòng)進(jìn)樣器
如果采用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，首先需要保證注射器里面沒有氣泡存在，否則影響進(jìn)樣量準(zhǔn)確性;其次是樣品瓶里面有足夠的樣品，保證進(jìn)樣針能夠吸到樣品。為了避免交叉污染需要定期對(duì)樣品瓶、蓋和墊進(jìn)行清洗。若自動(dòng)進(jìn)樣器長(zhǎng)時(shí)間不使用，應(yīng)該注意：腐蝕性的流動(dòng)相或洗液(例如，堿性或酸性緩沖溶液)必須*從系統(tǒng)中置換出來。同時(shí)，為了避免細(xì)菌的生長(zhǎng)，應(yīng)將一個(gè)樣品瓶中充滿甲醇，并重復(fù)幾次進(jìn)樣操作。
2、輸液系統(tǒng)
*按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。對(duì)液相色譜分析來說，*的流量穩(wěn)定性更為重要，這是因?yàn)榱魉俚淖兓瘯?huì)引起溶質(zhì)的保留值的變化，而保留值是色譜定性的主要依據(jù)之一。因此，恒流泵的應(yīng)用更廣泛。
*按工作方式分為氣動(dòng)泵和機(jī)械泵兩大類。機(jī)械泵中又有螺旋傳動(dòng)*、單活塞往復(fù)泵、雙活塞往復(fù)泵和往復(fù)式隔膜泵。
hplc使用的高壓泵應(yīng)滿足下列條件：
a 流量恒定，無脈動(dòng)，并有較大的調(diào)節(jié)范圍(一般為1～10ml/min)；
b 能抗溶劑腐蝕；
c 有較高的輸液壓力；對(duì)一般分離，60×105pa的壓力就滿足了，對(duì)分離，要求達(dá)到150～300×105pa。
(1)往復(fù)式柱塞泵結(jié)構(gòu)和原理
當(dāng)柱塞推入缸體時(shí)，泵頭出口(上部)的單向閥打開，同時(shí)，流動(dòng)相進(jìn)入的單向閥(下部)關(guān)閉，這時(shí)就輸出少量的流體。反之，當(dāng)柱塞向外拉時(shí)，流動(dòng)相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時(shí)關(guān)閉，一定量的流動(dòng)相就由其儲(chǔ)液器吸入缸體中。這種泵的特點(diǎn)是不受整個(gè)色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續(xù)供給恒定體積的流動(dòng)相。
(2)氣動(dòng)放大泵結(jié)構(gòu)和原理
其工作原理是：壓力為p1的低壓氣體推動(dòng)大面積(sa )活塞a，則在小面積(sb )活塞b輸出壓力增大至p2的液體。壓力增大的倍數(shù)取決于a和b兩活塞的面積比，如果a與b的面積之比為50：1 ，則壓力為5×105pa的氣體就可得到壓力為250×105pa的輸出液體。這是一種恒壓泵。
泵頭通常由兩部分組成--單向閥和密封圈-柱塞桿.單向閥一般由閥體\塑料\或陶瓷閥座和紅寶石球組成.在壓力的作用下寶石球離開閥座,流動(dòng)相流過單向閥;反之,在反向力的作用下,寶石球回到閥座上,此時(shí)流動(dòng)相不再流過單向閥.顯然寶石球與閥座之間的配合必須非常適合才能防止流動(dòng)相的泄漏.為了保證單向閥不發(fā)生泄漏,一些單向閥中安裝了兩套寶石球和閥座,也有一些單向閥是將寶石球用一個(gè)合適的彈簧壓在閥座上.在不同的應(yīng)用領(lǐng)域,單向閥閥體的材料有所不同,例如考慮生物兼容性的系統(tǒng),單向閥的閥體往往采用金屬鈦,而不用不銹鋼.為了降低成本和減少維護(hù)費(fèi)用,一些生產(chǎn)廠商還采用了可置換式的卡套式塑料單元件,當(dāng)然其功能仍保持不變
輸液系統(tǒng)即是指高壓恒流泵，其作用是能提供穩(wěn)定準(zhǔn)確的流速。
溶劑過濾頭：吸液過濾頭，或稱沉子，主要作用是過濾流動(dòng)相中可能存在的顆粒性雜質(zhì)。長(zhǎng)時(shí)間使用后，雜質(zhì)有可能阻塞溶劑過濾頭上的過濾板孔隙;或長(zhǎng)時(shí)間使用緩沖液，過濾頭表面容易產(chǎn)生一層膜，阻礙流動(dòng)相正常通過。嚴(yán)重時(shí)，即使是已超聲過的溶劑，泵吸液時(shí)也會(huì)有氣泡在四氟輸液管里產(chǎn)生，因此應(yīng)經(jīng)常對(duì)過濾頭進(jìn)行清洗。清洗溶劑可以選擇乙醇或者30%稀硝酸溶液，正相系統(tǒng)需注意濾頭的烘干處理。
單向閥：?jiǎn)蜗蜷y的作用是確保液體向一個(gè)方向流動(dòng)，是高壓恒流泵穩(wěn)定輸液的保證。日常使用過程中，可以通過觀察壓力的情況，初步判斷流量是否正常。如果系統(tǒng)已經(jīng)平衡一段時(shí)間，壓力應(yīng)該是穩(wěn)定的。但如果壓力存在波動(dòng)，則表明流量不穩(wěn)定;如果無壓力，則表明無流量。這兩種情況大多是因?yàn)閱蜗蜷y里混入了氣泡或雜質(zhì)。混入氣泡的情況，應(yīng)把放空閥打開，按沖洗鍵將里面的氣泡排出。單向閥混入雜質(zhì)的情況，須對(duì)其進(jìn)行清洗。清洗溶劑可以選擇乙醇，安裝時(shí)注意標(biāo)記環(huán)的方向。
密封圈：密封圈是固定在柱塞桿上防止泵腔內(nèi)的液體泄漏，是保證泵頭輸液正常的關(guān)鍵部件。但柱塞桿和柱塞密封圈長(zhǎng)期使用會(huì)發(fā)生磨損，主要與流量、操作壓力和所使用的流動(dòng)相有關(guān)。當(dāng)使用含鹽的流動(dòng)相時(shí)，由于脫水或蒸發(fā)，可能形成鹽結(jié)晶，而泵運(yùn)動(dòng)時(shí)鹽結(jié)晶會(huì)導(dǎo)致密封圈和柱塞桿的磨損。因此，每天實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后都需用純水沖洗一次密封圈(在柱塞密封圈和二級(jí)密封圈之間)，保持清洗管內(nèi)有水以防止形成晶體，延長(zhǎng)柱塞桿和密封圈的使用壽命。
在線過濾器：為了防止由于流動(dòng)相雜質(zhì)微粒進(jìn)入色譜系統(tǒng)，泵在放空閥內(nèi)安裝了在線過濾器，經(jīng)泵出口流出的液體通過在線過濾器，經(jīng)排空管流出的液體不通過在線過濾器。儀器使用一定時(shí)間后，建議用戶清洗在線過濾器的燒結(jié)不銹鋼過濾片。用扳手卸下壓帽，將密封環(huán)和燒結(jié)不銹鋼過濾片一同取出清洗，清洗后按原位裝上。清洗溶劑可以選擇30%稀硝酸溶液，正相系統(tǒng)需注意濾頭的烘干處理。
3、分離系統(tǒng)
分離系統(tǒng)包括色譜柱、保護(hù)柱以及柱溫箱。
色譜柱：色譜柱是樣品分離的核心。色譜柱在使用前必須仔細(xì)閱讀說明書，了解色譜柱使用的ph值范圍、溶劑耐受范圍、壓力范圍和維護(hù)方法等事項(xiàng)。色譜柱使用完后，需及時(shí)對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗。沖洗完成后，應(yīng)該將色譜柱從儀器上拆下來，兩端用廠家配的堵頭密封后，保存在色譜柱盒里。
保護(hù)柱：保護(hù)柱的作用主要是防止吸附性強(qiáng)的雜質(zhì)對(duì)色譜柱污染，從而延長(zhǎng)色譜柱的壽命。針對(duì)不同型號(hào)的色譜柱，應(yīng)選擇相對(duì)應(yīng)填料的保護(hù)柱。應(yīng)注意柱芯也是有壽命的，應(yīng)該定期進(jìn)行更換。
柱溫箱：色譜柱溫度變化，可能會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間的變化。為了避免這個(gè)問題，建議使用柱溫箱。
4、檢測(cè)系統(tǒng)
液相色譜常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器三種。
(1)紫外檢測(cè)器
該檢測(cè)器適用于對(duì)紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測(cè)。其特點(diǎn)是，使用面廣(如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用)、靈敏度高(檢測(cè)下限為10-10g/ml)、線性范圍寬、對(duì)溫度和流速變化不敏感、可檢測(cè)梯度溶液洗脫的樣品。
(2)示差折光檢測(cè)器
凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。目前，糖類化合物的檢測(cè)大多使用此檢測(cè)系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低(檢測(cè)下限為10-7g/ml)，流動(dòng)相的變化會(huì)引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測(cè)。
(3)熒光檢測(cè)器
凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測(cè)器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物(如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等)的測(cè)定，其靈敏度很高(檢測(cè)下限為10-12～10-14g/ml)，痕量分析和梯度洗脫樣品的檢測(cè)均可采用。
hplc常用的檢測(cè)器是紫外檢測(cè)器。在日常使用過程中紫外檢測(cè)器主要需要注意檢測(cè)池和氘燈的使用與維護(hù)。
檢測(cè)池：檢測(cè)池長(zhǎng)時(shí)間使用可能會(huì)造成污染，如果儀器的參比能量(ref energy)正常，測(cè)量能量(smpenergy)偏低，可能為檢測(cè)池污染導(dǎo)致，可以對(duì)檢測(cè)池進(jìn)行清洗。對(duì)檢測(cè)池零件的進(jìn)行清洗，一般先采用約1：4的硝酸溶液超聲清洗，分別用純水和甲醇溶液清洗，然后重新組裝并將檢測(cè)池池體推進(jìn)池腔內(nèi)，擰緊池板螺絲。注意組裝中，池玻璃及墊片一定要放正，以免壓碎池玻璃，造成檢測(cè)池泄漏。
氘燈：氘燈正常使用壽命可在1500小時(shí)以上。燈的使用壽命與檢測(cè)器的使用時(shí)間和開啟頻率有關(guān)，因此使用過程中應(yīng)盡量節(jié)省不必要的開機(jī)時(shí)間，減少開關(guān)頻率，以延長(zhǎng)氘燈的使用壽命。如果準(zhǔn)確地判斷出氘燈已經(jīng)不能點(diǎn)亮或能量太低，則需要更換新的氘燈。在購(gòu)買氘燈時(shí)，應(yīng)注意咨詢和核對(duì)氘燈的型號(hào)與儀器型號(hào)是否匹配。更換到氘燈時(shí)，參照儀器說明書中的相關(guān)內(nèi)容，特別要注意氘燈連接線的位置順序。
5、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
該系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。
色譜法的常用基本術(shù)語
1、色譜圖(chromatogram)：色譜柱流出物通過檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間或流動(dòng)相流出體積的曲線圖，或者通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ^察到的紙色譜或薄層色譜斑點(diǎn)、譜帶的分布圖。
2、(色譜)峰(chromatographic peak)：色譜柱流出組分通過檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的微分曲線。
3、峰底(peak base)：峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間的連接的直線。
4、峰高(h ，peak height)：色譜峰大值點(diǎn)到峰底的距離。
5、峰寬(w ，peak width)：在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)的距離。
6、半高峰寬(w h/2 ，peak withd at half height)：通過峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離。
7、峰面積(a ，peak area)：峰與峰底之間的面積。
8、拖尾峰(tailing peak)：后沿較前沿平緩的不對(duì)稱的峰。
9、前伸峰(leading peak)：前沿較后沿平緩的不對(duì)稱的峰。(又叫伸舌峰、前延峰)
10、假峰(ghost peak)：除組分正常產(chǎn)生的色譜峰外，由于儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現(xiàn)的色譜峰，即并非由試樣所產(chǎn)生的峰。這種色譜峰并不代表具體某一組分，容易給定性、定量帶來誤差。(又叫鬼峰)
11、畸峰(distrorted peak)：形狀不對(duì)稱的色譜峰，前伸峰、拖尾峰都屬于這類。
12、反峰(negative peak)：也稱倒峰、負(fù)峰，即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰。
13、原點(diǎn)(origin)：紙或薄層板上滴加試樣部位的中心點(diǎn)。
14、區(qū)帶拖尾(zone tailing)：由于物理、化學(xué)等作用的影響，一種組分在展開后形成的彗星形狀斑點(diǎn)。
15、基線(base line)：在正常操作條件下，僅有流動(dòng)相通過檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)曲線。
16、基線漂移(baseline drift)：基線隨時(shí)間定向的緩慢變化。
17、基線噪聲(n ，baseline noise)：由于各種原因而引起的基線波動(dòng)。
應(yīng)用領(lǐng)域
環(huán)境：常見無機(jī)陰陽離子、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、硝基化合物、有害重金屬及其形態(tài)、除草劑、 農(nóng)藥、酸沉降成分。
農(nóng)業(yè)：土壤礦物成分、肥料、飼料添加劑、茶葉等農(nóng)產(chǎn)品中無機(jī)和有機(jī)成分。
石油：烴類族組成、石油中微量成分。
化工：無機(jī)化工產(chǎn)品、合成高分子化合物、表面活性劑、洗滌劑成分、化妝品、染料。
材料：液晶材料、合成高分子材料。
食品：無機(jī)陰陽離子、有機(jī)酸、氨基酸、糖、維生素、脂肪酸、香料、甜味劑、防腐劑、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳烴。
生物：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然高分子化合物。
醫(yī)藥：人體化學(xué)成分、各類合成藥物成分、各種天然植物和動(dòng)物藥物化學(xué)成分。