干粉形式的重組蛋白在常溫下能夠保持穩(wěn)定，大多數(shù) mce 重組蛋白以干粉形式發(fā)貨。凍干粉在使用前需進(jìn)行溶解，這時(shí)候會(huì)?？吹揭晃荒吧质煜さ摹芭笥选薄d體蛋白。
溶解教學(xué)：
step 1:判斷實(shí)驗(yàn)周期。短期實(shí)驗(yàn)<=7 天，溶解材料：復(fù)溶緩沖液；長期實(shí)驗(yàn)>=7 天，溶解材料：復(fù)溶緩沖液、載體蛋白。
step 2:開蓋前離心。凍干粉在運(yùn)輸過程中，會(huì)因?yàn)橥饬σ蛩卣掣接诠鼙诨蛘吖苌w上，在開蓋之前，先通過離心操作，將凍干粉收集于管底，避免損失和浪費(fèi)。建議 10,000-12,000 rpm 高速離心 30 s；若沒有高速離心機(jī)，3,000-3,500 rpm 離心 5 min。
step 3:短期實(shí)驗(yàn)：向凍干粉中加入提供的復(fù)溶緩沖液，用槍頭輕輕吹打混勻，重懸至濃度不低于100 μg/ml。分裝每管不少于20μl.
長期實(shí)驗(yàn)：先用復(fù)溶緩沖液將蛋白溶解，再用含載體蛋白 (0.1% bsa，5% hsa，10% fbs，或 5% 海藻糖) 的溶液進(jìn)一步稀釋，濃度不低于 100 μg/ml，然后分裝凍存于 -20°c 至 -80°c。
下面就來給各位解答一下重組蛋白與載體蛋白的常見小問題~為什么重組蛋白要凍干？
蛋白質(zhì)對(duì)熱非常敏感，蛋白質(zhì)凍干可以使蛋白質(zhì)的大部分活性得以保留，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，延長儲(chǔ)存時(shí)間，同時(shí)降低運(yùn)輸成本。但凍干可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)喪失部分活性、聚集和其他退化問題，需通過添加保護(hù)劑(穩(wěn)定劑、添加劑、賦形劑)和控制各種凍干條件以盡可能減少負(fù)面影響。mce 大部分重組蛋白以凍干粉的形式提供，室溫下非常穩(wěn)定，支持常溫運(yùn)輸，為確保蛋白質(zhì) 100% 的活性，我們通常以冰袋運(yùn)輸，建議收到產(chǎn)品后 -20℃ 或 -80 ℃ 保存。
我應(yīng)該如何儲(chǔ)存重組蛋白？
對(duì)于長期儲(chǔ)存，蛋白質(zhì)溶液應(yīng)與載體蛋白(例如 0.1% bsa、10% fbs、5% hsa 和 5% 海藻糖)分裝保存，并在 -20°c 至 -80°c 下冷凍保存。在分裝凍存前，建議用含載體蛋白的溶液進(jìn)一步稀釋(濃度不低于 100 μg/ml)。保存產(chǎn)品時(shí)請(qǐng)避免反復(fù)凍融，每個(gè)冷凍-解凍循環(huán)都可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和降解。
載體蛋白使蛋白保存更穩(wěn)定的原理是什么？
塑料管壁對(duì)蛋白有很強(qiáng)的吸附作用，會(huì)導(dǎo)致重組蛋白粘附在管壁不易分離，進(jìn)而導(dǎo)致溶液中重組蛋白的實(shí)際濃度偏低，最終導(dǎo)致其活性下降。在復(fù)溶重組蛋白時(shí)，加入載體蛋可以預(yù)先封閉塑料管壁上蛋白結(jié)合位點(diǎn)，避免重組蛋白粘附于管壁。此外，載體蛋白也能維持蛋白在低溫條件下的穩(wěn)定，使其保持活性。如果在重組蛋白凍干粉復(fù)溶后，不用含載體蛋白的溶液進(jìn)一步稀釋，而是直接分裝凍存，則溶液中的大部分重組蛋白均會(huì)粘附到管壁上，導(dǎo)致溶液中實(shí)際溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度大大降低，最終表現(xiàn)為重組蛋白活性的下降。
含載體蛋白的溶液指的是什么溶液呢？水可以嗎？
為了維持一定的 ph 值跟鹽類濃度，避免蛋白不穩(wěn)定，不建議用水，該溶液通常建議選擇 ph 近中性、有一定緩沖能力的緩沖液，如pbs、培養(yǎng)基(rpmi1640, dmem 等)等。
海藻糖 or bsa 怎么選？
一般情況下，用于細(xì)胞或組織培養(yǎng)可以使用含有 bsa 載體的重組蛋白。但是，當(dāng)進(jìn)行某些實(shí)驗(yàn)，如體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、蛋白標(biāo)記時(shí)，bsa 可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)，則不適合使用添加 bsa 的重組蛋白。另外，如果實(shí)驗(yàn)平臺(tái)有特殊要求，也應(yīng)根據(jù)要求選擇不含 bsa 的蛋白。做無血清培養(yǎng)或動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞因子中不能含有 bsa，fbs 或 hsa 等動(dòng)物或人的蛋白，建議選擇5% 海藻糖作為載體蛋白。