基因編輯在免疫細(xì)胞治療中的應(yīng)用
1.基因編輯是什么？基因編輯是通過人工核酸酶技術(shù)將靶基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行敲除，插入等精確修飾的基因工程技術(shù)。目前基因編輯已經(jīng)在多個領(lǐng)域中有著重要的應(yīng)用，在腫瘤治療中主要與免疫治療相結(jié)合，尤其在免疫細(xì)胞治療上有巨大的發(fā)展前景。
2.基因編輯的分類？目前的基因編輯技術(shù)有可編程的核酸酶技術(shù)和be（base editors)及pe（prime editors）技術(shù)（圖1）。
圖1.基因編輯技術(shù)分類[1]
可編程核酸酶主要包括鋅指核酸酶(zfns)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(talens)以及crispr-cas核酸酶，這三種編輯方式都是將目的dna打斷后產(chǎn)生雙鏈斷裂（dsb），后續(xù)依賴非同源末端連接或同源定向重組的方式進(jìn)行修復(fù)。zfns是最早用于哺乳動物細(xì)胞基因編輯的人工核酸酶，通過鋅指結(jié)構(gòu)域識別dna序列并通過fok1的二聚體對dna進(jìn)行定點(diǎn)切割。zfns作為第一代基因編輯技術(shù)其基因修復(fù)方式多樣，對基因表達(dá)程度影響較小，但是其設(shè)計(jì)與篩選過程復(fù)雜，脫靶風(fēng)險高并且細(xì)胞毒性大。talens作為第二代基因編輯技術(shù)，結(jié)構(gòu)類似于zfns，其毒性較低且構(gòu)建容易。然而，talens在尺寸上比zfns大，組裝更加困難。后續(xù)出現(xiàn)的crispr-cas核酸酶的出現(xiàn)則開啟了新的基因編輯時代。相較于zfns和talens，crispr/cas具有良好的柔性和高效性，可以同時敲除多個基因位點(diǎn)，其中以crispr-cas9應(yīng)用最為廣泛。crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)包括cas9蛋白和單鏈向?qū)?rna (sgrna)，在sgrna的向?qū)峦ㄟ^堿基互補(bǔ)配對原則從而識別目的基因序列，并引導(dǎo)cas9蛋白酶有效切割dna雙鏈，形成雙鏈斷裂損傷后修復(fù)。
be系統(tǒng)主要由dcas9，sgdna和脫氨酶組成，通過對基因組 dna中的單核苷酸轉(zhuǎn)換以實(shí)現(xiàn)精確的基因校正，無需產(chǎn)生dsb，從而克服了核酸酶的許多限制，主要包括胞嘧啶堿基編輯器(cbe)和腺嘌呤堿基編輯器(abe)。pe則進(jìn)一步在be的系統(tǒng)引入逆轉(zhuǎn)錄酶，將切口酶與逆轉(zhuǎn)錄酶偶聯(lián)在一起，實(shí)現(xiàn)單堿基的轉(zhuǎn)換，敲除以及添加等操作。堿基編輯技術(shù)具有編輯效率高、編輯損傷少等特點(diǎn)，但是脫氨酶的使用可能會導(dǎo)致癌變風(fēng)險的增加，而且可能出現(xiàn)的脫靶效應(yīng)會嚴(yán)重影響編輯效率，其可靠性有待進(jìn)一步研究。
3.基因編輯在免疫細(xì)胞治療中的應(yīng)用近年來，免疫細(xì)胞療法在治療癌癥方面表現(xiàn)出優(yōu)異的療效，目前已經(jīng)有多款car-t療法在國內(nèi)外獲批上市，多種同種異體car-t療法，tcr-t細(xì)胞療法，til療法，car-nk療法也在臨床試驗(yàn)中獲得佳績。第三代基因編輯技術(shù)crispr/cas發(fā)展至今，目前已衍生出不同功能工具。在免疫細(xì)胞治療方面，crispr-cas技術(shù)已經(jīng)被廣泛的研究并且應(yīng)用（圖2）。
圖2.crispr技術(shù)在t細(xì)胞治療中的應(yīng)用[2]
利用crispr/cas9系統(tǒng)可以敲除供體t細(xì)胞的tcr和hla，可以有效避免移植物抗宿主病（gvhd）和免疫排斥反應(yīng)，該策略在開發(fā)通用型car-t細(xì)胞中已被廣泛應(yīng)用。除此之外，crispr-cas9技術(shù)可以通過敲除免疫檢查點(diǎn)（如pd-1，ctla-4，tim-3等）以及一些抑制性信號通路分子（如aar2，tgfbr2，dgks等），以提高t細(xì)胞在腫瘤免疫抑制微環(huán)境中的持久性，并增強(qiáng)其抗癌活性[2]。在tcr-t治療中，crispr基因編輯系統(tǒng)還可以用于敲除內(nèi)源性的tcrα和β基因，減少內(nèi)源性tcr的錯配，從而改善tcr-t細(xì)胞療法的抗癌活性，并且其安全性也在臨床實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。目前stadtmauer教授團(tuán)隊(duì)使用crispr技術(shù)同時敲除trac, trbc 和pdcd1三個基因，再通過慢病毒將ny-eso-1 tcr轉(zhuǎn)至t細(xì)胞中，這種生成的靶向ny-eso-1抗原的tcr-t細(xì)胞療法在３名患者中表現(xiàn)出良好的安全性[3]。crispr技術(shù)還可以通過同源重組的方式將帶有car基因的模板dna特異性的插入至特定的基因位點(diǎn)，無需使用傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄或者慢病毒載體，減少基因整合的風(fēng)險。justin eyquem將靶向cd19的car通過crispr/cas9定向插入t細(xì)胞的trac位點(diǎn)，可以有效調(diào)控car的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并減緩t細(xì)胞的分化和衰竭，增加t細(xì)胞治療效力[4]。除了cas9外，cas12a/cpf1也是腫瘤免疫細(xì)胞療法的有力工具。cpf1作為一種不需要tracrrna的crrna引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，可以同時對多個基因進(jìn)行編輯；與cas9相比，cpf1的脫靶率低；同時切割產(chǎn)生的粘性末端，讓dna插入更可控。陳斯迪教授課題組人員通過cpf1-aav系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了hdr介導(dǎo)的雙car敲入和免疫檢查點(diǎn)基因敲除（圖3）。相比于cas9制備的car-t細(xì)胞，aav-cpf1 kiko的car-t細(xì)胞有著更強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞能力，同時pd-1等耗竭型標(biāo)志物的表達(dá)水平更低[5]。2023年，該團(tuán)隊(duì)該開發(fā)了一個基于crispr的高效、高通量基因敲入平臺——clash，通過腺相關(guān)病毒（aav）文庫編碼大量同源重組修復(fù)模板，結(jié)合crispr-cas12a的mrna，從而實(shí)現(xiàn)大規(guī)模長鏈基因片段的精準(zhǔn)敲入[6]。
圖3.aav-cpf1介導(dǎo)的多重基因編輯流程[5]
近年來，除了健康供體外周血來源的pbmc外，ipsc在基因編輯技術(shù)的加持下，已逐漸發(fā)展為通用型細(xì)胞藥物的細(xì)胞來源之一。fate therapeutics公司的細(xì)胞藥物ft819，通過基因編輯將靶向cd19的新型car插入t細(xì)胞受體α基因座位點(diǎn)，進(jìn)而分化產(chǎn)生不受患者限制的ipsc來源的通用car-t細(xì)胞（圖4）。除了car-it外，fate還運(yùn)用ipscs解決nk細(xì)胞來源問題，從而規(guī)避外周血nk細(xì)胞數(shù)量不足和臍帶血nk細(xì)胞的倫理等風(fēng)險，通過敲除內(nèi)源性cd38提高nk細(xì)胞的適應(yīng)性并特異性預(yù)防cd38單抗介導(dǎo)的自相殘殺（圖5）。同時有研究發(fā)現(xiàn)，用基因編輯敲除ipsc來源的nk細(xì)胞的cish基因，能夠使nk細(xì)胞代謝重編程，并其在體內(nèi)的持久性和抗腫瘤活性[7]。
圖4 . ft819結(jié)構(gòu)
圖5.ft522結(jié)構(gòu)
crispr基因編輯系統(tǒng)作為一種強(qiáng)而有力的工具，還可以通過與高通量測序技術(shù)聯(lián)用，篩選能夠提高免疫療法療效的基因靶點(diǎn)，目前已經(jīng)有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了新的t細(xì)胞激活調(diào)節(jié)因子，t細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)因子，以及抗原處理/呈遞通路和干擾素通路中的創(chuàng)新靶點(diǎn)[8]（圖6）。西湖大學(xué)謝琦團(tuán)隊(duì)利用基于crispr 基因編輯系統(tǒng)的全基因組功能缺失性文庫分別對于car-t細(xì)胞和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（gbm中惡性程度最高的細(xì)胞群）進(jìn)行高通量無偏向的篩選，發(fā)現(xiàn)了多個能顯著提高靶向gbm的car t細(xì)胞抗腫瘤效力的新靶點(diǎn)[9]。除此之外，研發(fā)人員基于crispr-cas9開發(fā)出同源定向誘變（hdm）技術(shù)用于car序列的高通量的篩選[10]。
圖6.slice篩選平臺[8]
4.基因編輯在免疫細(xì)胞治療中的挑戰(zhàn)盡管基因編輯在提高免疫細(xì)胞治療效果方面顯示出巨大的潛力，但是由于其安全性和有效性等問題在一定程度上影響其向臨床轉(zhuǎn)化。
首先，對于基因編輯策略而言, 最大的擔(dān)憂是潛在的脫靶毒性，一旦發(fā)生脫靶，將導(dǎo)致非靶標(biāo)基因的改變或調(diào)控元件的破壞，會造成不可逆轉(zhuǎn)的后果。盡管利用預(yù)測軟件能夠分析出潛在脫靶位點(diǎn), 但是在一些非典型pam位點(diǎn)或者與靶點(diǎn)相似度較低位點(diǎn)仍然有可能有脫靶現(xiàn)象發(fā)生。同時，全基因組測序分析對于概率極低的脫靶現(xiàn)象也很有可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。近年來, 許多靈敏度的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)方法被開發(fā)出來例如guide-seq, circle-seq, change-seq等以幫助檢測潛在的低頻脫靶位點(diǎn)。新型基因編輯系統(tǒng)例如pe以及be編輯系統(tǒng)也逐漸應(yīng)用于免疫細(xì)胞治療中。這些方法在免疫細(xì)胞治療中的合理運(yùn)用將會對臨床實(shí)驗(yàn)的安全性起到重要的作用。同時以過繼性細(xì)胞治療為基礎(chǔ)的腫瘤免疫細(xì)胞治療，主要包括car-t細(xì)胞、tcr-t細(xì)胞和car-nk細(xì)胞治療等，均需要足夠數(shù)量的免疫細(xì)胞保證其臨床療效。目前大多數(shù)基于crispr/cas技術(shù)編輯的t細(xì)胞都是通過電穿孔的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，但是該方法對細(xì)胞損傷較大，致使細(xì)胞的活力下降并阻礙其體外增殖。因此，其他更安全、更高效的傳遞途徑亟待探索。
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