介紹
elisa（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）是蛋白質(zhì)檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法。1在本博客中，回顧了三種流行的 elisa 平臺(tái)：標(biāo)準(zhǔn) elisa、免疫 pcr和單分子陣列 (simoa)。我們將對(duì)這些 elisa 的設(shè)計(jì)原理、樣本量、儀器和靈敏度進(jìn)行比較。
elisa 的工作原理
elisa的基本設(shè)計(jì)原理取決于抗體-抗原相互作用的穩(wěn)定性和特異性。簡而言之，固定在珠子或微孔板等固體基質(zhì)上的捕獲抗體可與多種樣品類型中的目標(biāo)蛋白結(jié)合。此類樣品可包括血漿、血清、細(xì)胞和組織裂解物、條件培養(yǎng)基或尿液。
1971 年引入 elisa 時(shí)，酶標(biāo)記抗原被纖維素顆粒上的抗體捕獲。2然后通過反復(fù)離心和洗滌分離抗體-抗原綴合物。此后，不同的 elisa 格式被開發(fā)出來，包括夾心 elisa，其中目標(biāo)蛋白“夾在”捕獲抗體和標(biāo)記檢測(cè)抗體之間（圖 1）。這種 elisa 格式具有高度特異性，因?yàn)樾枰獌煞N抗體與蛋白質(zhì)結(jié)合才能進(jìn)行檢測(cè)。此外，可以用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定蛋白質(zhì)濃度（即定量數(shù)據(jù)）。
圖 1. 夾心 elisa 使用兩種抗體來靶向蛋白質(zhì)，從而具有高特異性。
這里討論的 elisa 平臺(tái)——標(biāo)準(zhǔn) elisa、免疫 pcr和單分子陣列 (simoa) ——是生成定量數(shù)據(jù)的夾心 elisa。然而，它們?cè)诘孜?、檢測(cè)方法、儀器、樣品體積和靈敏度方面有所不同。
標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
標(biāo)準(zhǔn) elisa (selisa) 將捕獲抗體固定到透明塑料 96 孔微孔板上（圖 2、表 1）。該檢測(cè)抗體與辣根過氧化物酶 (hrp) 結(jié)合，該酶可將其底物 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺 (tmb) 還原為藍(lán)色和氧化形式。顏色的變化與 hrp 的量成正比，并且推論與樣品中目標(biāo)蛋白的量成正比。添加硫酸可終止 hrp-tmb 反應(yīng)，導(dǎo)致顏色從藍(lán)色變?yōu)辄S色。使用酶標(biāo)儀在 450 nm 處測(cè)量吸光度。
圖 2. 標(biāo)準(zhǔn) elisa 的工作原理。標(biāo)準(zhǔn) elisa 使用 hrp 偶聯(lián)的檢測(cè)抗體和比色底物來檢測(cè)捕獲的蛋白質(zhì)。
標(biāo)準(zhǔn)免疫pcrsimoa™
基質(zhì) 96孔微孔板 96孔pcr板 珠子
檢測(cè)方法 比色法 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 熒光
樂器 讀板器 實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀 專用儀器
樣品量* 100微升 10-25 µl 125微升
靈敏度 高的 更高 最高
表 1. 標(biāo)準(zhǔn) elisa、免疫 pcr 和單分子陣列 (simoa) 的比較。 * = 樣品稀釋后每次重復(fù)的最終體積。
selisa 的靈敏度一般范圍為 1 pg/ml 至 100 pg/ml。然而，一些 selisa 的定量限 (lloq) 低至亞 pg/ml 或高達(dá) 10 ng/ml。與所有 elisa 一樣，靈敏度取決于所用抗體的靈敏度。
對(duì)于標(biāo)準(zhǔn) 96 孔板，最終樣品體積為每孔 100 µl。使用“半面積”板可以減少體積 (50 µl) ，其中孔的直徑為一半寬，但測(cè)定靈敏度也可能會(huì)降低。用于任何elisa 的原始樣品體積將取決于最佳樣品稀釋度，該稀釋度會(huì)因蛋白質(zhì)、樣品類型和實(shí)驗(yàn)而異。
將樣品添加到板中后，大約 5 小時(shí)內(nèi)即可獲得結(jié)果。然而，當(dāng)樣品和抗體同時(shí)添加到板中時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)更快的周轉(zhuǎn)時(shí)間。這減少了孵育步驟和洗滌步驟的數(shù)量。例如，speedelisa的處理時(shí)間為 3 小時(shí)，在添加樣品之前同時(shí)孵育板上的捕獲和檢測(cè)抗體。其他方法包括一步添加樣品和兩種抗體，或者將樣品和檢測(cè)抗體一起添加。然而，減少處理時(shí)間會(huì)降低靈敏度（圖 3）。
圖 3. 多步 selisa 和speede lisa 在靈敏度和檢測(cè)范圍方面的比較。針對(duì)人 (a) cd26 和 (b) 可溶性 il-6 受體 (il-6 sr) 的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)。兩種測(cè)定均使用相同的標(biāo)準(zhǔn)品和抗體對(duì)。使用 raybiotech life, inc.（peachtree corners，ga；美國）的 selisa 和 speedelisa 試劑盒對(duì)人 cd26 和 il-6 sr 進(jìn)行分析（cd26：selisa 試劑盒貨號(hào) elh-cd26，speedelisa 試劑盒貨號(hào) elhs-cd26）（ il-6 sr：selisa 試劑盒目錄號(hào) elh-il6sr，speedelisa 試劑盒目錄號(hào) elhs-il6sr）。 od = 光密度。
selisa 的主要優(yōu)點(diǎn)是提供低成本試劑盒，可以針對(duì)來自多個(gè)物種的數(shù)千種不同蛋白質(zhì)。此外，selisa 幾乎不需要培訓(xùn)，可生成易于解釋的數(shù)據(jù)，并使用與其他檢測(cè)兼容的經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的酶標(biāo)儀。這些優(yōu)點(diǎn)導(dǎo)致 selisa 在研究中得到廣泛使用。
免疫pcr (iqelisa tm )
免疫 pcr也稱為免疫定量 elisa (iqelisa)，將捕獲抗體粘附到塑料 96 孔 pcr 板上，同時(shí)檢測(cè)抗體與 dna 條形碼綴合（圖 4、表 1）。使用 pcr，雙鏈 (ds) dna 條形碼在條形碼特異性引物和與 dsdna 結(jié)合的熒光染料存在的情況下分別被擴(kuò)增和染色。熒光與 dsdna 的量成正比，因此也與樣品中目標(biāo)蛋白的量成正比。使用實(shí)時(shí) pcr 儀器測(cè)量熒光。
圖 4. 免疫 pcr 的工作原理。免疫 pcr 使用 dna 條形碼檢測(cè)抗體和 dsdna 熒光染料來檢測(cè)捕獲的蛋白質(zhì)。
iqelisa 的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其體積要求小，每次重復(fù)的最終體積僅為 10 µl。因此，當(dāng)樣品量有限或難以獲得樣品時(shí)，iqelisa 是一個(gè)特別有吸引力的選擇。然而，iqelisa 比 selisa 在技術(shù)上更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗枰_的移液。此外，樣品應(yīng)至少重復(fù)三次，因?yàn)樾◇w積會(huì)增加異常值的機(jī)會(huì)。
dna 通過 pcr 擴(kuò)增循環(huán)呈指數(shù)增長。因此，與使用相同抗原和抗體對(duì)的 selisa 相比，iqelisa 的 lloq 平均增加了 23 倍。靈敏度的增加取決于抗體，范圍從無變化到 105 倍（圖 5）。
從樣品孵育到數(shù)據(jù)收集，iqelisa 大約需要 5.5 小時(shí)。該周轉(zhuǎn)時(shí)間與 selisa 類似。
圖 5. selisa 和免疫 pcr 對(duì) 28 種蛋白質(zhì)的敏感性比較。 selisa 和免疫 pcr elisa 均使用每個(gè)靶標(biāo)的相同標(biāo)準(zhǔn)品和抗體對(duì)。該圖和圖 8 使用相同的 raybiotech life, inc. 的 selisa 試劑盒和 iqelisa 試劑盒。
單分子陣列 (simoa tm )
simoa是一種超靈敏 elisa，使用抗體包被的珠子和熒光偶聯(lián)的檢測(cè)抗體（圖 6、表 1）。將珠子、樣品和檢測(cè)抗體混合在一起后，將溶液施加到具有超過 235,000 個(gè)微孔的卡盒中。每個(gè)微孔只能容納一顆珠子。然后將油添加到卡盒中，將樣品推過微孔陣列的表面并形成孔的液密密封。
使用配備熒光顯微鏡的全自動(dòng)或半自動(dòng)系統(tǒng)測(cè)量熒光；該儀器由 simoa（ quanterix ；billerica，ma；美國）開發(fā)商制造。由于每個(gè)孔只能包含一個(gè)珠子，因此具有熒光的微孔的數(shù)量與樣品中目標(biāo)蛋白的量成正比。這使得單分子檢測(cè)成為可能。
圖 6. 單分子陣列的工作原理。 simoa 使用熒光偶聯(lián)檢測(cè)抗體和微孔來檢測(cè)捕獲的蛋白質(zhì)。
simoa 的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是它可以檢測(cè)飛摩爾范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)。也就是說，靈敏度通常在 10 fg/ml 至 1 pg/ml 范圍內(nèi)。與 selisa 和 iqelisa 相比，simoa 的平均靈敏度分別提高了 465 倍和 63 倍。
將試劑裝入 quanterix 儀器后，大約需要 3 小時(shí)才能獲取數(shù)據(jù)。因此，simoa 的程序時(shí)間比 selisa 和 iqelisa 都短。
雖然 simoa 實(shí)現(xiàn)了此處評(píng)測(cè)的三個(gè)平臺(tái)中的一些最高靈敏度，但該技術(shù)也有一些缺點(diǎn)。首先，目前使用該技術(shù)分析的蛋白質(zhì)數(shù)量很少（~165）。其次，simoa 試劑盒的成本高于 selisa 和 iqelisa 試劑盒。第三，檢測(cè)儀器價(jià)格昂貴，且只能用于simoa，是專用儀器，需要專門培訓(xùn)才能運(yùn)行。
圖 7. selisa 和 simoa 在靈敏度和檢測(cè)范圍方面的比較。通過將純化的人(a) il-6 或(b) tna α 添加到緩沖液中生成標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)。 raybiotech life, inc. 的每個(gè)靶標(biāo)的相同標(biāo)準(zhǔn)品和抗體對(duì)用于 selisa 和 simoa（il-6，selisa 目錄號(hào) elh-il6；tnf α，selisa 目錄號(hào) elh-tnf）。 y 軸 = 標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)，其中減去空白信號(hào)。信號(hào) = selisa 450 nm 處的 od 或 simoa 的每珠平均酶 (aeb)?？瞻?不含目標(biāo)蛋白的緩沖液。
多重elisa
值得一提的是，iqelisa 和 simoa 分別可以同時(shí)分析多達(dá) 3 個(gè)和 6 個(gè)目標(biāo)。除了需要更少的樣品之外，在分析相同數(shù)量的蛋白質(zhì)時(shí)，多重檢測(cè)通常比單重檢測(cè)更具成本效益。重要的是，多重檢測(cè)會(huì)降低 iqelisa 的靈敏度，而使用sr-x tm生物標(biāo)志物檢測(cè)系統(tǒng)的simoa 則不會(huì)影響靈敏度。
還提供其他定量多重 elisa 選項(xiàng)，包括 quantibody® 和 rayplex tm 抗體陣列。quantibody可以使用 100 µl 稀釋樣品在 6 小時(shí)內(nèi)分析多達(dá) 40 種蛋白質(zhì)，一式四份。使用兼容的激光掃描儀采集數(shù)據(jù)。rayplex可以使用流式細(xì)胞術(shù)在 4 小時(shí)內(nèi)每次重復(fù)使用 25 µl 稀釋樣品測(cè)量多達(dá) 25 種蛋白質(zhì)。兩種抗體陣列的靈敏度與 selisa 相似。
在我們的博客“使用抗體陣列進(jìn)行多重蛋白質(zhì)檢測(cè)”或我們的視頻“為您的研究識(shí)別正確的抗體陣列”中了解如何確定用于多重蛋白質(zhì)檢測(cè)的正確抗體陣列。
概括
標(biāo)準(zhǔn) elisa、免疫 pcr (iqelisa) 和 simoa 相互比較時(shí)具有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)：
selisa是一種簡單的比色測(cè)定法，數(shù)據(jù)易于解釋，因此幾乎不需要培訓(xùn)。使用能夠測(cè)量 450 nm 吸光度的酶標(biāo)儀在 5 小時(shí)內(nèi)獲得數(shù)據(jù)。使用比 iqelisa 和 simoa 試劑盒便宜的試劑盒可以靶向數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)。然而，與 iqelisa 和 simoa 相比，selisa 的靈敏度低。
免疫pcr使用實(shí)時(shí)pcr儀器，在6小時(shí)內(nèi)收集數(shù)據(jù)。在此介紹的三個(gè) elisa 平臺(tái)中，它的體積要求低，但比 selisa 需要更多的移液和數(shù)據(jù)分析技術(shù)專業(yè)知識(shí)。平均而言，其靈敏度比 selisa 高 23 倍?？梢酝瑫r(shí)檢測(cè) 3 種蛋白質(zhì)，但檢測(cè)靈敏度會(huì)降低。
simoa的靈敏度最高，其靈敏度平均分別比 selisa 和 iqelisa 提高了 465 倍和 63 倍。使用需要專門培訓(xùn)的昂貴專用儀器可在 3 小時(shí)內(nèi)獲得數(shù)據(jù)。它還需要比 selisa 和 iqelisa 更多的樣本量。一次可以分析多達(dá) 6 種蛋白質(zhì)，而不會(huì)影響靈敏度。
圖 8 表明，對(duì)于許多蛋白質(zhì)，lloq 的總體改進(jìn)遵循以下趨勢(shì)：simoa > iqelisa > selisa。不過，也有例外。例如，iqelisa 對(duì)人 il-1β 的靈敏度最高，為 0.0064 pg/ml，而 selisa 和 simoa 的 lloq 分別為 0.3 和 0.04 pg/ml。
圖 8. selisa、免疫 pcr 和 simoa 之間靈敏度倍數(shù)增加的比較。 raybiotech life, inc. 的每個(gè)靶標(biāo)的相同標(biāo)準(zhǔn)品和抗體對(duì)用于所有平臺(tái)。目標(biāo)包括 28 種人類蛋白質(zhì)、3 種小鼠蛋白質(zhì)和 1 種大鼠蛋白質(zhì)。(a) 17 種蛋白質(zhì)的靈敏度提高了 0 – 100 倍；不包括(b)或(c)中的蛋白質(zhì)。(b)九種蛋白質(zhì)的敏感性增加了 0 – 1,000 倍；不包括(a)或(c)中的蛋白質(zhì)。(c)兩種蛋白質(zhì)的敏感性增加了 0 – 10,000 倍；不包括(a)或(b)中的蛋白質(zhì)。 y 軸 = 與 x 軸下方描述的第二 elisa 平臺(tái)相比，第一個(gè) elisa 平臺(tái)的靈敏度增加倍數(shù)。水平線=中位數(shù)。
結(jié)論
最常見的蛋白質(zhì)檢測(cè)工具之一是 elisa。在這里，我們比較了三種流行的夾心 elisa 平臺(tái)：標(biāo)準(zhǔn) elisa、免疫 pcr和單分子陣列 (simoa)。在為研究選擇合適的 elisa 時(shí)，其底物、檢測(cè)方法、儀器、樣品量、靈敏度和成本是重要的考慮因素。標(biāo)準(zhǔn) elisa 是流行的方法，因?yàn)?可以使用低成本 試劑盒來靶向來自多個(gè)物種的數(shù)千種不同蛋白質(zhì)。此外，它幾乎不需要培訓(xùn)即可運(yùn)行，其數(shù)據(jù)易于解釋，并且使用非專用 酶標(biāo)儀 與其他測(cè)定兼容。一個(gè)關(guān)鍵要點(diǎn)是 elisa 靈敏度和成本之間需要權(quán)衡：靈敏度越高，成本越高。成本考慮了套件、培訓(xùn)、勞動(dòng)力和所需儀器的價(jià)格。因此，selisa 是實(shí)惠的選擇，而 simoa 是最敏感的。
對(duì)于不具備必要的專業(yè)知識(shí)或設(shè)備來使用此處討論的 elisa 平臺(tái)分析樣品的實(shí)驗(yàn)室，raybiotech life, inc. 提供完整的測(cè)試服務(wù)。該服務(wù)提供完整的報(bào)告，包括原始數(shù)據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)濃度。