點(diǎn)擊化學(xué)是一種多功能反應(yīng)，可用于合成各種綴合物。事實(shí)上，任何生物分子都可以使用點(diǎn)擊化學(xué)方法輕松地用小分子標(biāo)記，例如熒光染料、生物素等。
點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)發(fā)生在兩種組分之間：疊氮化物和炔烴（末端乙炔）。疊氮基和炔基在天然生物分子中幾乎從未遇到過。因此，該反應(yīng)具有高度生物正交性和特異性。如果需要標(biāo)記寡核苷酸，可以在許多定制寡核苷酸合成設(shè)施和公司訂購炔烴修飾的寡核苷酸。
使用下表計算點(diǎn)擊化學(xué)標(biāo)記所需的試劑體積。準(zhǔn)備所需的儲備溶液（見附錄）。
試劑混合物中的最終濃度原液濃度
炔烴修飾寡核苷酸 變化（20 — 200 um） 各不相同
疊氮化物 1.5 x（寡核苷酸濃度） 10 mm dmso 溶液
二甲基亞砜 50體積％ —
抗壞血酸 0.5毫米 5 mm 水中
銅-tbta絡(luò)合物 0.5毫米 10 mm，溶于 55 vol% dmso
將炔烴修飾的寡核苷酸或 dna溶解在耐壓小瓶中的水中。
添加2m 醋酸三乙銨緩沖液（ph 7.0）至終濃度 0.2 m。
添加dmso，并渦旋。
添加疊氮化物儲備溶液（dmso 中的 10 mm），并渦旋。
將所需體積的5mm 抗壞血酸儲備溶液添加到混合物中，并短暫渦旋。
通過向其中鼓泡惰性氣體 30 秒來對溶液進(jìn)行脫氣。可以使用氮?dú)?、氬氣或氦氣?br>將所需量的10 mm 銅 (ii)-tbta 庫存在 55% dmso 中添加到混合物中。用惰性氣體沖洗小瓶并蓋上蓋子。
渦旋混合物。如果觀察到明顯的疊氮化物沉淀，則將小瓶在 80°c 下加熱 3 分鐘，然后渦旋。
在室溫下保存過夜。
用丙酮（對于寡核苷酸）或乙醇（對于 dna）沉淀結(jié)合物。
沉淀寡核苷酸綴合物：
向混合物中添加至少 4 倍過量體積的 3% 高氯酸鋰丙酮溶液（如果混合物體積很大，則分成幾個小瓶）。
沉淀 dna 綴合物：
向混合物中添加乙酸鈉至終濃度0.3m；
添加 2.5 體積的乙醇（或 0.8 體積的異丙醇）。
充分混合并在-20°c下保持20分鐘。
10000 rpm 離心 10 分鐘。
丟棄上清液。
用丙酮 (1 ml) 洗滌沉淀，以 10000 rpm 離心 10 分鐘。
棄去上清液，干燥沉淀，并通過 rp-hplc 或 page 純化綴合物。