minutetm內(nèi)體及細(xì)胞組分分離試劑盒目錄號ed-028描述：
初級內(nèi)體（ee）是次級成熟內(nèi)體的起點，初級內(nèi)體主要是由內(nèi)吞的囊泡相互融合形成。初級內(nèi)體不僅僅通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的信號通路接受胞吞物，還有其他許多通路。胞吞機制除了在維持正常細(xì)胞生理中起到重要作用，還在阿爾茲海默病和遺傳性溶酶體儲積癥等許多疾病中發(fā)揮了很大作用。傳統(tǒng)分離內(nèi)體的方法是采用密度梯度超速離心法，需要大量起始原材料，方法繁瑣費時。minutetm內(nèi)體分離試劑盒基于離心管柱法，快速簡單，僅需要少量的培養(yǎng)細(xì)胞或者毫克級的組織樣品。本試劑盒可以從培養(yǎng)的細(xì)胞和組織樣品中大量沉淀富集初級內(nèi)體，有助于該領(lǐng)域的研究。
試劑盒組分
1.緩沖液a15ml
2.緩沖液b15ml
3.2根塑料研磨棒
4.20個離心管柱
5.20個收集管
6.組織分離粉2.5克
所需附加材料
1xpbs
渦旋震蕩儀
臺式離心機
儲存：
儲存于4oc
重要產(chǎn)品信息
1.仔細(xì)閱讀整個操作說明。將離心管柱和接收管套管放置于冰上預(yù)冷。
2.所有離心步驟都需要在4oc室溫下或者低溫離心機中進(jìn)行。
3.研究蛋白磷酸化，磷酸酶抑制劑應(yīng)在使用前加入緩沖液a中。蛋白酶抑制劑可以選擇添加或不添加，如添加在使用前加入緩沖液a中。
4.推薦使用bca試劑盒用于蛋白濃度測定
操作方法：
1.將離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷。
2.培養(yǎng)的細(xì)胞樣品。低速離心（500-600xg，5分鐘）收集10-30x106細(xì)胞，接第3a步。組織樣品接第3b步。
3.3a.用預(yù)冷的pbs清洗細(xì)胞，*去除上清，加500ul緩沖液a將細(xì)胞重懸，并放置于冰上孵育5-10分鐘，大力渦旋振蕩10-30秒，立即將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管柱中，接第4步。
3b.組織樣品。將10-20mg組織樣品（新鮮或冷凍）放置于離心管柱上，加200ul緩沖液a，用塑料棒反復(fù)擠壓扭轉(zhuǎn)研磨1分鐘。（注：如果樣品是骨骼肌和心肌，建議在研磨時添加80-100mg組織分離粉到離心管柱上）再加入300ul緩沖液a到離心柱里，用移液器上下吹打幾次，開蓋冰上孵育5分鐘，接第4步。
注意：一些未均質(zhì)組織的存在不會影響樣品的質(zhì)量。塑料棒可以重復(fù)使用，用70%的酒精清洗即可。
4.蓋上蓋子，16000xg離心30秒（建議使用可在10s內(nèi)升至16000xg的臺式離心機）。離心后可將收集管中的樣品重懸，再過一次柱子以增加最終內(nèi)體的產(chǎn)量。
5.棄去離心管柱，將收集管的液體渦旋振蕩混勻10秒，700xg離心2-3分鐘（沉淀為完整的細(xì)胞核和一些未破裂的細(xì)胞）
6.將上清轉(zhuǎn)移至一個新的1.5ml離心管中，16000xg，4oc離心30-60分鐘（延長離心時間可以提高純度）。離心后，再次將上清轉(zhuǎn)移至一個新的1.5ml離心管中（沉淀為大的細(xì)胞器和質(zhì)膜）。
7.估算管中溶液體積，加入一半體積的緩沖液b,振蕩混勻（樣品與緩沖液b的比例為2：1，也可以根據(jù)最終內(nèi)體得率按照0.25：1或者1：1減少或增加緩沖液b的量）4oc孵育1h或過夜（延長時間可以增加產(chǎn)量）。
8.10000xg，4oc離心30分鐘，棄掉上清（上清是胞漿組分，可選擇保留），沉淀即是內(nèi)體。產(chǎn)量通常在20-100ug每個樣品。內(nèi)體可以根據(jù)下游實驗選擇任何溶解液重懸溶解。推薦使用下表中minutetm系列溶解液溶解內(nèi)體蛋白。
推薦按照下游實驗應(yīng)用選擇以下蛋白溶解液
產(chǎn)品名稱
貨號
下游實驗應(yīng)用
minute™變性蛋白溶解液
wa-009
sds-page電泳，wb，胰酶消化，用生物素
標(biāo)記或組氨酸標(biāo)記純化蛋白質(zhì)等實驗
minute™變性蛋白溶解液
wa-010
elisa，ip，co-ip，酶活性檢測等其他應(yīng)用
minute™質(zhì)譜專用蛋白溶解液
wa-011
胰酶消化及后續(xù)的質(zhì)譜分析
關(guān)鍵詞：臺式離心機 離心機 移液器