在體內(nèi)，最佳的t細(xì)胞活化既是一個(gè)機(jī)械過程，也是一個(gè)生化過程。piezo1是一種機(jī)械敏感離子通道，響應(yīng)物理力，例如流體剪切應(yīng)力（fss）而開放，并允許鈣離子內(nèi)流。鈣內(nèi)流導(dǎo)致 piezo1 將物理刺激轉(zhuǎn)化為生化反應(yīng)，因?yàn)殁}是參與多種信號(hào)通路的第二信使。其中一條通路是t細(xì)胞活化，因?yàn)殁}內(nèi)流會(huì)增加活化t細(xì)胞核因子（nfat）、核因子κb（nf-κb）和激活蛋白1（ap-1）的活化。然后，這些轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子在持續(xù)的t細(xì)胞活化、分化和細(xì)胞毒性中起重要作用。先前的一項(xiàng)研究表明，流體剪切應(yīng)力（fss）誘導(dǎo)單個(gè)t細(xì)胞中的鈣內(nèi)流，這表明通過piezo1激活的fss可能具有促炎作用。
在美國范德堡大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的一項(xiàng)研究中，用fss處理jurkat和原代人t細(xì)胞，通過以0.5-5.0 dyn/cm2的fss 梯度處理t細(xì)胞來研究生理性fss的效果。然而，在病理生理學(xué)背景下，高血壓的血壓異常屬于血流動(dòng)力學(xué)的改變，與細(xì)胞因子水平異常相關(guān)，并與多種自身免疫性疾病相關(guān)。在高血壓患者血管網(wǎng)絡(luò)的某些區(qū)域，血流速度降低，fss降低。在其他區(qū)域，血流速度增加，fss升高。了解fss與改變的t細(xì)胞活化之間的關(guān)系可以為高血壓患者自身免疫性疾病的治療確定新的治療靶點(diǎn)。這項(xiàng)研究是第一個(gè)確定fss增強(qiáng)t細(xì)胞活化的研究，觀察結(jié)果表明，piezo1和其他機(jī)械敏感離子通道可能是自身免疫性疾病的治療靶點(diǎn)，或用于改善過繼性t細(xì)胞免疫療法。
fss 增強(qiáng)用 cd3/cd28 抗體處理的 jurkat 細(xì)胞中的 zap70 磷酸化
利用永生化jurkat細(xì)胞系，模擬cd3 / cd28抗體聯(lián)合體外fss（5.0 dyn/cm2，1h）對(duì)t細(xì)胞的激活作用（圖1 a）。在整個(gè)fss實(shí)驗(yàn)中，將剪切應(yīng)力值保持在靜脈和動(dòng)脈水平，分別為0.5-4.0 dyn/cm2和 4.0-30.0 dyn/cm2。為了確定fss暴露水平是否對(duì)細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，測量了細(xì)胞活力。5.0 dyn/cm2 的fss持續(xù)1小時(shí)未顯著降低細(xì)胞活力。
首先用不含抗體的fss處理jurkat細(xì)胞，以確定單獨(dú)fss的激活作用。通過測量zeta鏈相關(guān)蛋白激酶-70（zap70）磷酸化來量化，zap70 在cd3激活后磷酸化，是t細(xì)胞活化的必要步驟。與靜態(tài)對(duì)照相比，單獨(dú)的fss僅導(dǎo)致zap70磷酸化增加10%（圖1 b）。當(dāng)cd3/cd28抗體與fss聯(lián)合時(shí)，與僅抗體或未處理的對(duì)照相比，zap70磷酸化顯著增加，約50%（圖1 c）。然后用不同幅度的fss處理jurkat細(xì)胞，以確定t細(xì)胞活化對(duì)剪切應(yīng)力的“幅度反應(yīng)”。實(shí)驗(yàn)觀察到zap70磷酸化的增加與fss幅度呈正相關(guān)（圖1 d）。此外，還測量了jurkat zap70磷酸化對(duì)fss-抗體處理時(shí)間的依賴性。隨著fss持續(xù)時(shí)間的增加，zap70磷酸化顯著增加（圖1 e）。
圖1 cd3 / cd28抗體和fss處理對(duì)zap70的磷酸化作用。
fss 聯(lián)合 cd3/cd28 抗體可增加 jurkat 細(xì)胞中晚期 t 細(xì)胞活化標(biāo)志物的表達(dá)
為了正常激活t細(xì)胞，需要激活轉(zhuǎn)錄因子nfat、nf-κb和ap-1來轉(zhuǎn)錄重要的蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子，例如腫瘤壞死因子α（tnf-α）、il-2和干擾素γ（ifn-γ）。實(shí)驗(yàn)用fss聯(lián)合cd3/ cd28抗體刺激jurkat細(xì)胞1小時(shí)后測量每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的活化。結(jié)果觀察到，nfat-核共定位顯著增加（圖2 a），而且fss與cd3 / cd28抗體的組合顯著增加了nf-κb和ap-1的活化。
fss處理1小時(shí)后測量細(xì)胞因子tnf-α，il-2和ifn-γ的表達(dá)，以確定三種轉(zhuǎn)錄因子的激活增加是否與維持t細(xì)胞功能和激活所需的蛋白質(zhì)表達(dá)增加相關(guān)。與對(duì)照組相比，當(dāng)jurkat細(xì)胞用fss處理1小時(shí)時(shí)，每種細(xì)胞因子的表達(dá)均顯著增加。fss處理后24小時(shí)后測量了活化標(biāo)志物cd69和cd25的表達(dá)。與對(duì)照組相比，fss-抗體處理組和僅抗體處理組均顯示cd69和cd25表達(dá)增加。
fss下cd3 / cd28抗體包被珠增加了jurkat細(xì)胞的活化
實(shí)驗(yàn)還用cd3 / cd28抗體包被的磁珠測試了fss，以確定fss是否也可以增強(qiáng)使用磁珠激活的jurkat細(xì)胞的活化。用或不用fss聯(lián)合抗體包被的磁珠刺激jurkat細(xì)胞1小時(shí)。與僅磁珠和未處理的對(duì)照相比，fss處理顯著增加了zap70的磷酸化。與未處理的對(duì)照相比，單獨(dú)磁珠對(duì)照組的zap70磷酸化也顯著增加，但不如fss處理組明顯（圖2 a）。此外，在用磁珠處理1小時(shí)后fss也顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄因子nf-κb和cfos的磷酸化。單獨(dú)磁珠對(duì)照組僅顯著增加了cfos的磷酸化，而不是nf-κb（圖2 b、c）。當(dāng)用cd3 / cd28包被珠處理jurkat細(xì)胞時(shí)，fss也顯著增加了jurkat細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)。與對(duì)照組相比，tnf-α、il-2和ifn-γ在fss條件下均大幅上調(diào)（圖2 d）。
圖2 fss通過cd3 / cd28包被磁珠增加活化。
fss增強(qiáng)jurkat細(xì)胞中t細(xì)胞的活化具有piezo1 和鈣依賴性
為了確定fss增強(qiáng)的t細(xì)胞活化是否通過鈣內(nèi)流起作用，在無鈣或含鈣的hbss緩沖液中用抗體加fss的組合處理jurkat細(xì)胞1小時(shí)。用fss和抗體在含鈣緩沖液中處理的jurkat細(xì)胞顯示出zap70磷酸化顯著增加。在無鈣緩沖液中用fss和抗體處理的jurkat細(xì)胞沒有顯示出zap70磷酸化的顯著增加（圖3 a）。接下來，用或不用鈣螯合劑egta以2mm的濃度預(yù)處理jurkat細(xì)胞30分鐘，觀察到用egta，fss和抗體處理的jurkat細(xì)胞zap70磷酸化顯著降低（圖3 b）。
為了確定piezo1是否可能在fss增強(qiáng)的t細(xì)胞活化中發(fā)揮作用，實(shí)驗(yàn)在fss和抗體處理前30分鐘用10 μm gsmtx-4 處理jurkat細(xì)胞。gsmtx-4是piezo1的相對(duì)特異性抑制劑，但已知也會(huì)抑制其他機(jī)械敏感通道。gsmtx-4導(dǎo)致用fss和抗體處理的jurkat細(xì)胞的zap70磷酸化顯著降低（圖3 c）。這表明fss通過誘導(dǎo)導(dǎo)致鈣內(nèi)流的機(jī)械敏感離子通道的激活來增強(qiáng)t細(xì)胞活化。為了更具體地量化piezo1是負(fù)責(zé)fss增強(qiáng)jurkat細(xì)胞活化的離子通道的程度，利用crispr/cas9技術(shù)敲除jurkat細(xì)胞中piezo1。在jurkat piezo1 敲除細(xì)胞中，與未處理或僅抗體處理的細(xì)胞相比，fss處理不會(huì)增加zap70磷酸化。然而，在cas9對(duì)照jurkat細(xì)胞中，fss處理顯著增加了zap70磷酸化。此外，當(dāng)兩者都用fss處理時(shí)，與jurkat piezo1 敲除細(xì)胞相比，cas9對(duì)照jurkat細(xì)胞中的zap70磷酸化顯著更高（圖3 d）。
實(shí)驗(yàn)還研究了鈣內(nèi)流的下游效應(yīng)，以確定它們是否在fss存在下增強(qiáng)t細(xì)胞活化方面發(fā)揮作用。肌動(dòng)蛋白聚合先前已被確定為有效t細(xì)胞活化所必需的，并受鈣內(nèi)流調(diào)節(jié)。在fss處理前30分鐘用30 μm細(xì)胞松弛素d（ccd）預(yù)處理jurkat細(xì)胞以抑制肌動(dòng)蛋白聚合。ccd顯著降低了與fss-抗體處理相關(guān)的增加的zap70磷酸化，同時(shí)在僅抗體條件下沒有顯著改變jurkat細(xì)胞的活化（圖3 e）。
鈣調(diào)磷酸酶是一種磷酸酶，在鈣內(nèi)流下游被激活，并與nf-κb激活有關(guān)。為了確定鈣調(diào)磷酸酶是否被鈣內(nèi)流激活以增加轉(zhuǎn)錄因子活化，通過用5 μm環(huán)孢菌素a（csa）預(yù)處理jurkat細(xì)胞30分鐘來抑制鈣調(diào)磷酸酶。csa處理顯著降低了用fss和抗體處理的jurkat細(xì)胞中的nf-κb磷酸化，表明fss激活鈣調(diào)磷酸酶以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子的激活（圖3 f）。
圖3 鈣內(nèi)流對(duì)于jurkat細(xì)胞中fss增強(qiáng)t細(xì)胞激活至關(guān)重要。
fss增強(qiáng)原代t細(xì)胞的活化
為了獲得更生理性的t細(xì)胞活化模型，并確定fss處理的活化效果是否與臨床中的t細(xì)胞療法相關(guān)，實(shí)驗(yàn)用抗體和fss處理原代人t細(xì)胞1小時(shí)。fss增強(qiáng)了cd4和cd8-陽性t細(xì)胞亞群中zap70的磷酸化。這種趨勢在nf-κb磷酸化中也很明顯，cd4和cd8陽性t細(xì)胞的nf-κb磷酸化顯著增加。如上所述，細(xì)胞因子表達(dá)是t細(xì)胞活化和功能的另一個(gè)重要步驟。因此，fss處理1小時(shí)后，測量兩個(gè)亞群中原代t細(xì)胞的tnf-α，il-2和ifn-γ的表達(dá)。在cd4和cd8陽性t細(xì)胞中，與未處理和僅抗體的對(duì)照相比，用fss和cd3 / cd28抗體處理t細(xì)胞時(shí)，所有三種細(xì)胞因子均顯著增加。
圖4 fss和cd3 / cd28抗體增強(qiáng)t細(xì)胞活化的示意圖。
fss激活piezo1，使鈣流入。鈣內(nèi)流增加zap70磷酸化，并激活轉(zhuǎn)錄因子nfat，nf-κb和ap-1。這反過來又導(dǎo)致細(xì)胞因子（如il-2）的表達(dá)增加。
總之，該研究表明，5.0 dyn/cm2的生理fss當(dāng)受到cd3/cd28抗體刺激時(shí)可以增強(qiáng)t細(xì)胞的活化。然而，該研究結(jié)果也可能與病理生理狀態(tài)有關(guān)，如高血壓。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過zap70磷酸化測量，fss幅度的增強(qiáng)進(jìn)一步增加了t細(xì)胞活化。高血壓與身體某些部位（如左右頸總動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈）的血流速度增加有關(guān)，因此fss增加。在這些疾病中，已知t細(xì)胞都起著重要作用。這項(xiàng)研究的結(jié)果以及高血壓與自身免疫性疾病之間的相關(guān)性表明，抑制t細(xì)胞中的piezo1和其他機(jī)械敏感離子通道可能對(duì)自身免疫性疾病和細(xì)胞因子釋放綜合征具有治療潛力。
參考文獻(xiàn)：hope jm, dombroski ja, pereles rs, lopez-cavestany m, greenlee jd, schwager sc, reinhart-king ca, king mr. fluid shear stress enhances t cell activation through piezo1. bmc biol. 2022 mar 9;20(1):61. doi: 10.1186/s12915-022-01266-7. pmid: 35260156; pmcid: pmc8904069.