α-淀粉酶 ( α-al) 活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
規(guī)格：100t/48s
產(chǎn)品內(nèi)容：
試劑一：液體 20ml×1 瓶，室溫保存。若有黃色晶體析出，可適當(dāng)加熱溶解后再用。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 10ml 蒸餾水，置于常溫水中并加熱至煮沸，期間 不斷攪拌粉劑至溶解。
標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1 支，10mg 無水葡萄糖，臨用前加 1ml 蒸餾水，配成 10mg/ml 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。
產(chǎn)品說明：
淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-al (ec 3.2. 1. 1)隨機催化淀粉中α- 1,4-糖苷鍵水解，生 成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。
淀粉水解酶催化淀粉水解生成還原糖，還原糖還原 3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質(zhì)，在 540 nm 有吸收峰；通過測定 540 nm 吸光度增加速率，計算淀粉酶活性。α-al 耐熱，但是β-淀粉酶可在 70℃ 鈍化 15min 。因此粗酶液經(jīng)過 70℃鈍化 15min ，就只有α-al 能夠催化淀粉水解。
需自備的儀器和用品：
酶標(biāo)儀或可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、96 孔板/微量比色皿、 研缽和蒸餾水。
操作步驟：
一、粗酶液提?。?br>稱取約 0. 1g 樣本，加 0.8 ml 蒸餾水勻漿；勻漿后在室溫下放置提取 15min ，每隔 5min 振蕩 1
次，使其充分提取；6000g ，室溫離心 10min ，吸取上清液并且加蒸餾水定容至 10 ml ，搖勻，即為 淀粉酶原液。
二、測定步驟和加樣表 (在 ep 管中依次加入下列試劑)：
1 、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長到 540 nm ，蒸餾水調(diào)零。
2 、將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為 1 、0.5 、0.25 、0. 125 、0.0625 、0.03125 、0.015625 、0.0078 和 0.0039mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3 、按操作表依次加入各試劑：
試劑 (μl)對照管測定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管
α- 淀粉酶原液7575--
蒸餾水---75
標(biāo)準(zhǔn)溶液 (mg/ml)--75-
70℃水浴 15min 左右，冷卻
試劑一150---
將以上對照管、測定管和試劑二置于 40℃恒溫水浴中保溫 10min 左右
試劑二75757575
在 40℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫 5min
試劑一-150150150
混勻，90℃ 水浴 10min ，取 200μl 至 96 孔板或微量比色皿中，540nm 處讀取對照管、測定管、 標(biāo)準(zhǔn)管、空白管的吸光度，分別記為 a 對照、a 測定、a 標(biāo)準(zhǔn)和 a 空白，計算δa 測定=a 測定-a 對照，δa 標(biāo)準(zhǔn)=a 標(biāo)準(zhǔn)-a 空白。
三、α-淀粉酶活性計算：
1 、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以δa 標(biāo)準(zhǔn)為 y 軸，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為 x 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程 y=kx+b 。將δa 測定帶 入方程得到 x (mg/ml)。
2 、α- 淀粉酶活性的計算
a. 按照樣本鮮重計算
單位定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg 還原糖定義為1個酶活力單位。
α- 淀粉酶活性(mg/min/g 鮮重)=x×v 樣÷(w×v 樣÷v 樣總)÷t=2×x÷w
b. 按照蛋白質(zhì)濃度計算
單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg 還原糖定義為1個酶活性單位。 α-淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= x×v 樣÷ (v 樣×cpr) ÷t=0.2×x÷cpr
v 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.075 ml；v 樣總：提取液總體積，10 ml； cpr：樣本蛋
白質(zhì)濃度，mg/ml；w：樣本鮮重，g；t ：反應(yīng)時間，5min。
注意事項：
當(dāng)測定的吸光值大于 1.5 時，可以對樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后測定。
本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用！請勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測等用途！
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