安氏ⅱ類錯牙合是口腔正畸學(xué)中的一種臨床疾病。功能矯治器是一種本身不產(chǎn)生任何機械力，通過改變頜面部的肌肉環(huán)境，促進頜發(fā)育及顱面骨骼生長的一類矯正器。機械力信號被傳遞到細胞中并促進骨骼肌重塑。因此，闡明拉伸誘導(dǎo)的細胞凋亡的潛在機制對于進一步優(yōu)化臨床治療非常重要。
細胞凋亡的機制是多種多樣的，其中比較常見的有三種機制，分別為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ers）、線粒體通路和死受體通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊和修飾是一個高度調(diào)控的過程。然而，各種內(nèi)源性和外源性應(yīng)激可以破壞細胞器中的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也會導(dǎo)致自噬。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，有助于自噬發(fā)生的ire1-jnk、perk-eif2α和akt-tsc-mtor信號通路在ers條件下被激活。
未折疊蛋白反應(yīng)（upr）是一種高度保守的適應(yīng)性機制，有三個分支協(xié)調(diào)對未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)的有害累積的反應(yīng)。它們包括：肌醇需求酶1α（ire1α）、蛋白激酶r樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（perk）和激活轉(zhuǎn)錄因子6（aft6）。chop，caspase-12和jnk是三個與er相關(guān)的信號通路。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在骨骼肌重塑中拉伸誘導(dǎo)的細胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用。激活的atf-6進入細胞核以促進upr相關(guān)蛋白的表達。這增加了er的生物合成能力，從而使細胞在ers下存活。當(dāng)ers被觸發(fā)和延長時，atf-6還可以激活chop等下游蛋白，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。然而，atf-6信號通路在骨骼肌重塑中的作用尚不清楚。
bcl-2家族蛋白對于調(diào)節(jié)各種細胞的凋亡至關(guān)重要。據(jù)報道，bcl-2通過與beclin1相互作用來調(diào)節(jié)自噬，beclin1被稱為自噬的標(biāo)記蛋白。bcl-2 對自噬和凋亡的信號通路存在交叉調(diào)控。然而，目前尚不清楚atf-6通路是否參與拉伸誘導(dǎo)的成肌細胞的凋亡和自噬。
為了解決這個問題，青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔正畸科、青島市立醫(yī)院口腔科的研究團隊曾研究了拉伸誘導(dǎo)的成肌細胞凋亡和自噬的潛在分子機制，這有助于闡明機械拉伸產(chǎn)生的ers條件下自噬與細胞凋亡之間的關(guān)系。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 apoptosis 期刊題為“dual role of endoplasmic reticulum stress-atf-6 activation in autophagy and apoptosis induced by cyclic stretch in myoblast”。
首先，為了確認機械拉伸對細胞活力的影響，將成肌細胞暴露于15% 伸長率的循環(huán)機械拉伸下（每循環(huán)提供6 秒的機械拉伸）分別持續(xù)0、6、12和24小時，結(jié)果表明，機械拉伸顯著降低了細胞活力，呈時間依賴性抑制了成肌細胞的生長。接著采用tunel染色和av/pi流式細胞術(shù)分析了機械拉伸的促凋亡作用，數(shù)據(jù)表明，成肌細胞的凋亡率隨著負荷時間逐漸升高，并在24 小時時達到最大值?；谶@些結(jié)果，得出結(jié)論，機械拉伸誘導(dǎo)成肌細胞凋亡是時間依賴性的。
為探究ers對拉伸誘導(dǎo)的成肌細胞凋亡的作用，采用qrt-pcr和蛋白質(zhì)印跡法檢測ers標(biāo)志基因（grp78、atf-6、chop和caspase-12）的表達。結(jié)果表明，ers相關(guān)基因的mrna水平隨著拉伸時間的增加而上調(diào)，并在24小時時達到峰值（圖1 a）。用機械拉伸處理24 小時后，er相關(guān)基因蛋白的表達水平與mrna表達呈相似升高（圖1 b）。這說明，循環(huán)拉伸激活ers介導(dǎo)的細胞凋亡。
圖1 循環(huán)拉伸激活ers介導(dǎo)的細胞凋亡。（a）通過實時pcr檢測grp78，atf-6，chop和caspase-12的表達。（b）具有代表性的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示拉伸對grp78，atf-6，chop和caspase-12 蛋白質(zhì)水平的影響。
接下來，為了闡明自噬在機械應(yīng)力下牙頜面肌肉重塑中的作用，實驗使用蛋白質(zhì)印跡檢測自噬相關(guān)蛋白（lc3-ii、p62、beclin1）的表達。結(jié)果表明，beclin1和lc3-ii在拉伸組中的表達呈時間依賴性顯著升高，而p62隨著拉伸時間的延長而降低。而且循環(huán)拉伸24 小時后，成肌細胞中雙膜自噬體的數(shù)量增加。lc3-ii積累表明自噬體形成增加或自噬體-溶酶體融合受損。這些結(jié)果表明，機械拉伸處理后成肌細胞發(fā)生細胞自噬。
為了進一步證實ers在拉伸誘導(dǎo)的細胞凋亡和自噬中的作用，在成肌細胞中使用erss抑制劑4-pba。ers被4-pba預(yù)處理抑制（圖2 a）。4-pba成功降低了beclin1的蛋白質(zhì)水平，拉伸誘導(dǎo)的成肌細胞中的lc3ii降低，但沒有降低p62（圖2 a）。如圖2 b所顯示，抑制ers緩解拉伸誘導(dǎo)的成肌細胞凋亡。此外，循環(huán)拉伸增加了紅色和黃色點狀體的百分比，而4-pba處理抑制了此效果。這表明4-pba處理顯著緩解了拉伸誘導(dǎo)的自噬（圖2 c）。這些結(jié)果表明，ers參與拉伸誘導(dǎo)的細胞凋亡和自噬。
圖2 ers對拉伸誘導(dǎo)的成肌細胞凋亡和自噬的作用。（a）在有或沒有4-pba時機械拉伸下grp78，atf-6，chop，bcl-2，lc3和beclin1表達水平的蛋白質(zhì)印跡分析。 （b）進行tunel染色以評估細胞凋亡水平。（c）在成肌細胞中進行免疫熒光測定以確定自噬水平，并顯示lc3斑點的定量分析。
最后，為了進一步闡明自噬的作用及其與ers和細胞凋亡的關(guān)系，使用3-ma抑制成肌細胞的自噬。與單獨機械拉伸組相比，3-ma和機械拉伸的聯(lián)合處理顯著增強了chop的表達。同時，3-ma處理也增加了凋亡細胞的數(shù)量。然而，3-ma對ers標(biāo)志物（grp78和atf-6）沒有明顯影響。此外，3-ma顯著增加了拉伸誘導(dǎo)的成肌細胞凋亡。這些結(jié)果表明，自噬參與拉伸誘導(dǎo)的成肌細胞凋亡，但可能對ers沒有明顯影響。從圖2 a表明，4-pba預(yù)處理顯著改善了成肌細胞中l(wèi)c3ii/i和細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達。然而，抑制自噬對ers相關(guān)蛋白grp78和atf-6的表達沒有明顯影響。這意味著，循環(huán)拉伸暴露下自噬不是ers 的原因。
上述結(jié)果表明，atf-6可能在拉伸誘導(dǎo)的自噬和細胞凋亡中起重要作用。因此，為進一步闡明其在機械拉伸誘導(dǎo)的成肌細胞凋亡和自噬中的作用，創(chuàng)建了atf-6沉默的成肌細胞，在循環(huán)拉伸之前用atf-6 sirna3轉(zhuǎn)染成肌細胞（圖3 a）。數(shù)據(jù)顯示，機械拉伸對成肌細胞的凋亡作用減弱（圖3 c）。敲低atf-6可以顯著降低chop的水平，增加bcl-2的水平，cleaved caspase-12 表達無變化。這意味著，atf-6通過循環(huán)拉伸處理的成肌細胞中的bcl-2和chop通路在ers介導(dǎo)的細胞凋亡中發(fā)揮作用。這些結(jié)果表明，atf-6通路在調(diào)節(jié)拉伸誘導(dǎo)的成肌細胞凋亡和自噬過程中起著至關(guān)重要的作用。
圖3 atf-6在成肌細胞中拉伸誘導(dǎo)的自噬和凋亡中起重要的作用。
（a）蛋白質(zhì)印跡和實時pcr結(jié)果證實，在sirna3轉(zhuǎn)染的成肌細胞中，atf-6水平被敲低最多。（b）蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染sirna或不轉(zhuǎn)染sirna后，拉伸成肌細胞中chop、 cleaved caspase-12、bcl-2、lc3、beclin1和p62的表達水平（c）通過膜聯(lián)蛋白v-fitc染色檢測細胞凋亡。（d）用mrfp-gfp-lc3腺病毒轉(zhuǎn)染24小時，轉(zhuǎn)染sirna或不轉(zhuǎn)染sirna后，免疫熒光測定成肌細胞中的自噬。
綜上所述，這項研究表明，成肌細胞在體外經(jīng)歷循環(huán)拉伸，并通過凋亡和自噬方式對機械拉伸做出反應(yīng)，這與atf-6介導(dǎo)的ers通路密切相關(guān)。在機械拉伸下，自噬被誘導(dǎo)。這削弱了成肌細胞凋亡的過程，這已被確定為防止細胞死亡的作用。該研究解釋了atf-6通路在拉伸誘導(dǎo)的細胞凋亡和自噬的分子機制中的作用，確保了對功能性器具影響成肌細胞的機制有充分的了解。然而，在拉伸刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的成肌細胞凋亡和自噬之間發(fā)生的串?dāng)_需要進一步闡明。因此，未來的研究可以闡明ers，細胞凋亡和自噬參與拉伸成肌細胞的確切相互作用機制。
參考文獻：zhang q, liu g, liu r, liu j, zeng x, ren d, yan x, yuan x. dual role of endoplasmic reticulum stress-atf-6 activation in autophagy and apoptosis induced by cyclic stretch in myoblast. apoptosis. 2023 jun;28(5-6):796-809. doi: 10.1007/s10495-023-01825-5. epub 2023 mar 7. erratum in: apoptosis. 2023 jul 13;: pmid: 36881290.
原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36881290/
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