引言 植物藥越來(lái)越受到人們的重視。據(jù)報(bào)道，*大約有70%的人口醫(yī)療依靠各種類型的植物藥〔1，2〕。對(duì)植物藥的興趣主要基于以下兩個(gè)原因，一是人們普遍認(rèn)為植物藥具有較小的毒性，二是用合成方法尋求新藥物的可能性變得越來(lái)越小，同時(shí)已有的西藥對(duì)一些疑難病癥無(wú)能為力。隨著對(duì)植物藥需求的不斷增長(zhǎng)，開展植物藥的藥代動(dòng)力學(xué)、毒理學(xué)研究和質(zhì)量控制，開發(fā)快速、靈敏、具有選擇性的分析方法也越來(lái)越迫切。過(guò)去20年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，液相色譜（hplc）是一種非常有效和普遍適用的植物藥分析方法。近來(lái)，由于各種分析柱、高選擇性和高靈敏度的檢測(cè)器和復(fù)雜的商品化儀器聯(lián)用系統(tǒng)的出現(xiàn)，植物藥分析領(lǐng)域已被大大地推進(jìn)。本文就hplc在中藥及植物藥研究中應(yīng)用的進(jìn)展做簡(jiǎn)要評(píng)述。
2 色譜技術(shù)方面的進(jìn)展
2.1 固定相
在過(guò)去的幾年里，出現(xiàn)許多適于堿性物質(zhì)分離的商品色譜柱, 其填料具有更好的重現(xiàn)性、更高的耐酸堿穩(wěn)定性以及不易受次級(jí)保留影響。此外，使用新的固定相載體和將各種配體鍵合到常用的載體上，從而提高了反相色譜、離子色譜、離子交換色譜填料的選擇性。與此同時(shí)，新的手性固定相不斷出現(xiàn)，應(yīng)用范圍不再局限于個(gè)別的化合物〔3〕。
theodoridis比較了專門為堿性化合物的hplc分析設(shè)計(jì)的新柱添料，其中包括有硅膠基體的c18-羥基、硅膠基體的c18和c8、硅膠基體的甲基苯基-丙基甲硅烷基、以氧化鋁和聚苯乙烯-二乙烯基苯為基體的聚丁二烯填料。在每個(gè)被檢驗(yàn)柱子上進(jìn)行了流動(dòng)相優(yōu)化，并研究了流動(dòng)相ph、有機(jī)改性劑性質(zhì)、含量和鹽濃度對(duì)保留選擇性和分離度的影響。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)基于分析物間pka值的差異進(jìn)行分離時(shí)，洗脫液的ph值是影響分離的一個(gè)重要因素。堿性化合物在這樣的c18柱和聚合物柱上能得到滿意的分離結(jié)果，這些新柱填料已被用于金雞納生物堿和長(zhǎng)春花生物堿的分析〔4，5〕。
*，光學(xué)異構(gòu)體有不同的藥理活性。kusu等〔6〕用一手性配位體交換柱，以1 mmol/l醋酸銅和20 mmol/l醋酸銨（ph=6.4）的混合水溶液為流動(dòng)相直接拆分了柑橘屬植物、中藥材、中藥中的脫氧腎上腺素光學(xué)異構(gòu)體，在0.2～100 μmol/l濃度范圍內(nèi)有很好的線性(r=0.999)，檢測(cè)限可達(dá)0.2 μmol/l (s/n=3)。
一系列具有兩個(gè)或三個(gè)活性中心的四環(huán)、五環(huán)長(zhǎng)春花生物堿的立體異構(gòu)體能夠在手性α1-酸糖蛋白（agp）和人血清白蛋白（has）柱上得到分離〔7〕。以磷酸鹽緩沖溶液（ph 5～7）/乙腈（acn）或異丙醇為流動(dòng)相，比較兩種柱上得到的譜圖，發(fā)現(xiàn)這類化合物與agp固定相有更大的親合力。在應(yīng)用范圍和立體選擇性方面，agp柱都優(yōu)于has柱。
2.2 檢測(cè)
紫外檢測(cè)仍是zui普遍的檢測(cè)方法，與此同時(shí)其它檢測(cè)方法顯示出了不可替代的優(yōu)越性。
2.2.1 電化學(xué)檢測(cè)器
kusu和其合作者〔8〕在分析枳實(shí)和枳殼中的脫氧腎上腺素，n-甲基酪胺時(shí)發(fā)現(xiàn)電化學(xué)檢測(cè)器不僅有特殊的選擇性，而且具有很高的靈敏度，而以往用紫外檢測(cè)需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理才能避免樣品中其它組分的干擾。在kaseisorb lc-ods-120-5色譜柱上，以0.02 mol/l檸檬酸-0.02 mol/l nah2po4（7：3 v/v，ph=3）為流動(dòng)相，檢測(cè)電位1.2 v(vs. ag/agcl)，*為內(nèi)標(biāo)，脫氧腎上腺素、n-甲基酪胺的檢測(cè)限分別為1.3 μg/l和1.2 μg/l。青蒿素及其類似物既無(wú)強(qiáng)紫外吸收也無(wú)熒光發(fā)色團(tuán)，且沒(méi)有合適的衍生反應(yīng)，因此很難對(duì)它們及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行hplc分析，chan〔9〕用hplc-電化學(xué)檢測(cè)器（ecd）測(cè)定了血漿中的青蒿素。
2.2.2 光電二極管陣列檢測(cè)器
光電二極管陣列檢測(cè)器已被普遍用于鑒別液相色譜的峰純度和提高重疊峰的定量準(zhǔn)確度〔10，49，63，64〕。美登（maytus）中的美登類化合物（maytansinoids）是一類很強(qiáng)的抗癌藥物，這類物質(zhì)具有很相似的結(jié)構(gòu)，分子間的差異很小，給分析帶來(lái)困難。reich等人〔11〕利用varian 9065二極管陣列檢測(cè)器為這類物質(zhì)建立了一個(gè)光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，即使在分析物沒(méi)有得到基線分離的情況下，這一譜庫(kù)也能大大簡(jiǎn)化在復(fù)雜植物萃取物的未知基質(zhì)中識(shí)別已知化合物。在此基礎(chǔ)上，分別在硅膠、雙醇基、氨基和氰基柱上對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，基于分子大小和與固定相的相互作用提出了此類物質(zhì)復(fù)雜的保留機(jī)理。
2.2.3 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（elsd）
elsd是一種質(zhì)量型檢測(cè)器，流動(dòng)相被氣流霧化后進(jìn)入加熱管，在管內(nèi)溶劑被揮發(fā)，一束狹窄光通過(guò)分析物粒子后發(fā)生散射，散射光由光電倍增管收集，它的響應(yīng)取決于被分析物粒子的大小和數(shù)目。由于elsd只對(duì)不揮發(fā)的物質(zhì)響應(yīng)，其特點(diǎn)是，即使在梯度洗脫的情況下也能得到比較平穩(wěn)的基線?，F(xiàn)在這一檢測(cè)器已被成功地用于不揮發(fā)物質(zhì)的分析，如：糖類、脂類、活性劑等。人參是常用的強(qiáng)身滋補(bǔ)品，有抗疲勞、鎮(zhèn)靜、抗胃潰瘍等效用。許多研究表明，這些藥效源于活性組分人參皂甙。由于人參皂甙缺少發(fā)色團(tuán)，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)這類物質(zhì)時(shí)，只能在短波區(qū)。在短波區(qū)內(nèi)檢測(cè)，用梯度洗脫同時(shí)分離多個(gè)人參皂甙時(shí)，基線漂移嚴(yán)重，影響分析的準(zhǔn)確度。park等〔12〕用hplc-elsd同時(shí)分離和測(cè)定了人參皂甙rb1、rb2、rc、rd、re、rf、rg1、rg2、rg3 和rh1等。elsd的管溫設(shè)置在145℃，n2流量40 mm(轉(zhuǎn)子流量計(jì)單位)，檢測(cè)限在35～155 ng之間。此方法的靈敏度和選擇性都優(yōu)于hplc-uv，在一次洗脫中完成主要人參皂甙的定量分析。
2.2.4 質(zhì)譜
近來(lái)，液相色譜-質(zhì)譜（lc-ms）聯(lián)用，尤其是液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜（lc-ms-ms），已成為發(fā)展zui快的分析技術(shù)之一。樣品引入由zui早的傳送帶到目前液體樣品的直接引入，離子化技術(shù)由熱噴霧（tsp）、連續(xù)流快原子轟擊（cf-fab）、粒子束接口（pb），發(fā)展到現(xiàn)在的大氣壓化學(xué)電離（apci）和電噴霧離子化（esi）。 pb 的缺點(diǎn)是對(duì)難揮發(fā)性物質(zhì)的靈敏度低，因此不適于天然產(chǎn)物中極性物質(zhì)的分析；熱噴霧接口雖已成功地用于極性和難揮發(fā)物質(zhì)的分析，但對(duì)操作條件卻有很高的要求。cf-fab克服了tsp 的一些缺陷，但設(shè)備上的要求又使這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用受到限制。電噴霧接口是在常溫常壓下離子從液相直接被引入，而大氣壓化學(xué)電離（apci）的樣品離子是經(jīng)過(guò)化學(xué)電離產(chǎn)生的，離解過(guò)程對(duì)溫度控制的要求不像tsp-ms那么嚴(yán)格，在同樣的汽化條件下可用于更多化合物的分析。esi過(guò)程取決于溶液的化學(xué)性質(zhì)、待分析離子的電遷移和表面行為。與esi相反，apci過(guò)程則取決于氣相的化學(xué)性質(zhì)，如：氣體的酸堿性〔13〕。在質(zhì)譜中所采用的接口技術(shù)受樣品極性的影響。隨樣品極性從非極性至離子型逐漸增加，按如下順序采用相應(yīng)的質(zhì)譜接口：氣相色譜（gc）、pb、tsp、apci和esi。apci有較寬的使用范圍，從非極性到離子型化合物都可分析〔14〕。
新的接口技術(shù)和離子化方法的發(fā)展使hplc-ms在分析化學(xué)上起著不可替代的作用。植物類天然產(chǎn)物成分復(fù)雜，甚至含有多達(dá)幾千種組分，但往往只是一種化合物和植物的藥效或毒性有關(guān)，因而在分離植物萃取物中的活性組分時(shí)，希望檢測(cè)技術(shù)能為色譜峰提供盡可能多的定性信息。質(zhì)譜技術(shù)部分地滿足了這種需要。
前面已經(jīng)提到，人參皂甙是人參萃取物中的活性組分，由于它缺少發(fā)色團(tuán)，限制了紫外檢測(cè)器的應(yīng)用。1995年van breemen等〔15〕采用電噴霧離子化法，將lc-ms技術(shù)用于分析人參粗提物中的人參皂甙?；诜肿与x子峰和基準(zhǔn)物的保留時(shí)間等信息，未經(jīng)衍生的人參皂甙rg1、re、rd、rc、rb2和rb1直接被檢測(cè)出來(lái)。chuang等用紫外和電噴霧質(zhì)譜（esi-ms）檢測(cè)，測(cè)定黃連中的7種生物堿〔16〕。通過(guò)追蹤選定的離子來(lái)解決重疊峰問(wèn)題，用誘導(dǎo)碰撞分解反應(yīng)獲得單個(gè)組分的結(jié)構(gòu)信息。50 min內(nèi)分離測(cè)定了黃連粗提物中的berberstine、黃連堿、小檗堿、巴馬亭、藥根堿、表小檗堿和非洲防己堿。wada 等〔17〕用lc-apsi-ms測(cè)定了日本烏頭中的生物堿。另有報(bào)道〔18〕用tsp-ms分析銀杏中的銀杏苦內(nèi)酯，檢測(cè)限可達(dá)1 ng，靈敏度可以和gc-ms相媲美。gobbato等〔19〕為了克服紫外檢測(cè)選擇性低，二極管陣列檢測(cè)對(duì)結(jié)構(gòu)類似的雙黃酮分辨不清等缺陷，用hplc-tsp-ms分析了銀杏提取物中的雙黃酮。zui近，brolis等用hplc-二極管陣列檢測(cè)（dad），hplc-tsp-ms和hplc-esi-ms檢測(cè)，在一個(gè)反相大孔c18柱上分析了連翹中黃酮類、萘蒽酮類、間苯三酚類等16種組分〔20〕。
2.3 計(jì)算機(jī)模擬優(yōu)化
在分離復(fù)雜的混合物時(shí)，計(jì)算機(jī)模擬優(yōu)化正在發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。drylab是一個(gè)商品計(jì)算機(jī)軟件，能夠快速、系統(tǒng)地開發(fā)hplc方法的專家系統(tǒng)。僅僅依靠?jī)纱晤A(yù)實(shí)驗(yàn)，便可得到有關(guān)色譜條件的大量信息。此軟件已被廣泛用于各種樣品的hplc分析方法的開發(fā)，如核酸、蛋白質(zhì)及復(fù)雜的天然產(chǎn)物等〔21〕。metzger等〔22〕用drylab軟件輔助優(yōu)化，從而確定了*的梯度時(shí)間、陡度、洗脫液的ph、柱類型、流速程序等，對(duì)番瀉果和葉中的17個(gè)蒽醌類化合物進(jìn)行了分離測(cè)定。在兩次預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，一個(gè)常規(guī)控制銀杏質(zhì)量的hplc分析方法的開發(fā)僅用了8 h，預(yù)測(cè)的可靠性令人滿意，預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值之間的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.4%〔23〕。另外，借鑒已有的分析黃酮的實(shí)驗(yàn)條件，dzido用drylab優(yōu)化了分析蜀葵屬植物中的黃酮類的梯度洗脫方法〔24〕。本實(shí)驗(yàn)室用drylab開發(fā)了hplc測(cè)定大黃中羥基蒽醌類化合物的方法。在優(yōu)化條件下，對(duì)比了不同產(chǎn)地大黃中有效成份的差異，并考察了樣品制備方法對(duì)提取效率的影響〔25〕。
2.4 其它
由于中藥劑型的復(fù)雜多樣，識(shí)別中藥中的摻假物對(duì)于質(zhì)檢部門來(lái)說(shuō)無(wú)疑是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。商用系統(tǒng)remedi hs已被用于檢查中藥中人工合成的中性堿性摻假物〔2〕。這個(gè)系統(tǒng)包括一個(gè)在線樣品凈化裝置和一個(gè)含有555個(gè)藥物和代謝物的數(shù)據(jù)庫(kù)。在消費(fèi)者提供的五種中草藥中苯甲二氮、利眠寧、sulpiride、etenzamide、*和胃復(fù)安等合成藥物被識(shí)別出來(lái)。