使用ace方法開發(fā)工具包(mdks)進行色譜柱篩選
方法開發(fā)的四個簡化步驟
• ace mdks包括了為互補選擇性而精心設(shè)計的3支色譜柱。
• 色譜柱篩選是一種簡單而又功能強大的方法, 可以快速識別合適的色譜柱。
• 通過篩選2種不同的流動相有機改性劑可以使方法更全面。
• 以下的流程圖總結(jié)了如何通過4個簡單步驟執(zhí)行方法開發(fā)篩選。
開始
步：選擇流動相ph和緩沖液
根據(jù)分析物性質(zhì) (即pka, logp和logd數(shù)據(jù)) 進行選擇。對于未知分析物，使用酸性流動相作為起點。
第二步：使用ace 方法包 (3或6支色譜柱)
梯度掃描以meoh和mecn作為有機溶劑,進行5-95％梯度篩選。
第三步：查看數(shù)據(jù)
選擇蕞佳色譜柱和有機改性劑。
第四步：方法優(yōu)化
如有必要, 檢查溫度, ph值, 梯度斜率,梯度范圍等。
是否實現(xiàn)分離？
是-方法開發(fā)完成
否-改變流動相條件（ph值,緩沖液等），回到第二步繼續(xù)實驗。
選擇色譜柱和粒徑尺寸。
由lc系統(tǒng)和用戶的偏好決定。對于400 bar的hplc系統(tǒng)來說, 5μm 150 x 4.6mm是個不錯的選擇。
對于600 bar優(yōu)化的hplc系統(tǒng), 可使用2 和3μm粒徑的較短色譜柱 (如100mm)。1.7μm粒徑的短柱 (如50mm)適用于uhplc系統(tǒng)。
如何確定合適的篩選梯度時間？
梯度時間可以使用公式1計算。
vm可用公式2計算。
tg = 梯度時間 (mins.)
k* = 梯度保留系數(shù) (通常設(shè)置約為5)
δφ = 梯度范圍 (即對于5-95％b梯度，δφ= 0.9)
vm = 柱內(nèi)體積 (ml)
s = 5 對于小分子 (＜1000沓)
f = 流速 (ml/min)
l = 色譜柱長度 (mm)
dc = 柱內(nèi)徑 (mm）
請務(wù)必記住在下一次注射前, 在梯度洗脫后以至少10倍vm (柱內(nèi)體積) 進行一次等度重新平衡。
為何使用色譜柱篩選？
• 改變色譜柱的固定相可能對選擇性造成顯著影響 (圖1)。
• 在相同的流動相條件下, 篩選不同的色譜柱可以幫助您以更高的分辨率更快地實現(xiàn)所需的分離。
圖1：改變色譜柱固定相的影響。
色譜柱：50x2.1mm
流動相：a = 0.1％甲酸的水溶液，b = 含0.1%甲酸的甲醇:水(9:1 v/v)
梯度：5分鐘內(nèi)3-100%b，
流速：0.06ml/min
溫度：40°c
檢測：uv，254nm
樣品：1）*，2）芐醇，3）*，4）*，5）羥苯甲酯，6）1,2-二硝基苯
• ace mdks將具有不同相互作用機制的色譜柱組合在一起, 以大限度地提高選擇性并增加分離具有挑戰(zhàn)性的混合物的可能性。
• 性價比高, ace mdks與單支色譜柱價格相同！
• 兩種蕞受歡迎的ace反相 (rp) mdk (參見下表) 包括了為利用不同的保留機制和大化選擇性而*設(shè)計的相。
• 所有六個相都可以在反相 (rp) 條件下使用, 并且具有與c18一樣的穩(wěn)定性。
1近似值– 通過半定量機制加權(quán)和/或通過參考使用>100特征分析物的其他ace相來確定。
• 其他的ace方法包還有hilic分析包, 生物大分子300å分析包和實心核(ultracore) 分析包
• 同樣提供微孔柱尺寸 (內(nèi)徑0.5和1.0mm)。
成功范例
*及有關(guān)物質(zhì)
• 基于分析物的pka和logd來選擇流動相ph值。
• 使用meoh或mecn作為常見的方法開發(fā) (c18）的起點無法分離所有的分
析物。所以, 需要進一步的方法開發(fā)。
• 使用6支色譜柱/2次流動相篩選, 即刻就可識別6種方案。
• 無須進一步的方法開發(fā)了！
條件：
色譜柱: 2 μm 100 x 3.0mm
流動相:
a = 20mm 乙酸胺 ph6.0
b = 有機溶液含有 (20mm 乙酸胺 ph6.0):水 (9:1 v/v)
梯度：10分鐘內(nèi)5-95%b
流速：1.2 ml/min
柱溫：40 °c
進樣體積：2 μl
樣品：
1）* (*)
2）4-氨基*
3）對苯二酚
4）2-氨基*
5）2-乙酰胺基*
6）*
7）4-硝基*
8）2-硝基*
9）4-氯乙酰