細胞培養(yǎng)基本概念
細胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，使其生長繁殖，并維持其結(jié) 構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以是單個細胞，也可以是細胞群。
細胞培養(yǎng)目的與用途
1、科學研究：藥物研究開發(fā)與基礎(chǔ)研究 藥物研究與開發(fā)
(1) 新藥篩選：如化學合成藥物藥效研究、中藥有效成分篩選與鑒定等。
(2) 疫苗研究與開發(fā)：如病毒性疫苗的研究與開發(fā)（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫 瘤疫苗(多肽疫苗)等。
(3) 基因工程藥物研究與開發(fā)：如干擾素研究與開發(fā)，細胞生長因子研究與開發(fā)等。
(4) 細胞工程藥物研究與開發(fā)：生物活性多肽研究與開發(fā)，人參皂甙、*等生物活 性成分研究與開發(fā)。
(5) 單克隆抗體制備：包括診斷用單克隆抗體，治療用單克隆抗體。
基礎(chǔ)研究
(1) 藥物作用機理
(2) 基因功能
(3) 疾病發(fā)生機理
2、 生物制藥
(1) 疫苗生產(chǎn)：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫瘤疫苗(多肽疫苗)
等。
(2) 基因工程藥物生產(chǎn)：如在臨床醫(yī)學中具有治療價值的一些細胞生長因子如干擾素、 粒細胞生長因子、*等
(3) 診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn)
(4) 細胞工程藥物生產(chǎn)：生物細胞內(nèi)的一些生物活性多肽，生物活性物質(zhì)等
細胞培養(yǎng)基本條件
1、合適的細胞培養(yǎng)基
合適的細胞培養(yǎng)基是體外細胞生長增殖的zui重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細胞營養(yǎng) 和促使細胞生長增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，而且還提供培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。
2、血清
目前，大多數(shù)合成培養(yǎng)基都需要添加血清。血清是細胞培養(yǎng)液中zui重要的成分之一，含有細胞生長所需的多種生長因子及其它營養(yǎng)成分。
3、無菌無毒細胞培養(yǎng)環(huán)境
無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。在體外培養(yǎng) 的細胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者 自身代謝物質(zhì)積累，可導致細胞中毒死亡。因此，在體外培養(yǎng)細胞時，必須保持細胞 生存環(huán)境無菌無毒，及時清除細胞代謝產(chǎn)物。
4、恒定的細胞生長溫度
維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。
5、合適的氣體環(huán)境
氣體是哺乳動物細胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。
細胞培養(yǎng)基種類與基本成分
細胞培養(yǎng)基的種類很多，按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基（目前使用的培養(yǎng)基 絕大部分是合成培養(yǎng)基），按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類。干粉培養(yǎng)基 需由實驗者自己配制并滅菌，液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供，用戶可直接使用，非常方便。 每種細胞都有其合適的培養(yǎng)基，詳見附表 1。
1、合成培養(yǎng)基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、無機鹽、維生素及其它輔助物質(zhì)
氨基酸
氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨 基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨
酰胺是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少*時，細胞生長不良而死亡。
因此，各種培養(yǎng)液中都有較大量的*。但是，由于*在溶液中很不穩(wěn)定，應 置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含*的培養(yǎng)液在 4℃冰箱中儲 存 2 周以上時，還應重新加入原來量的*。
碳水化合物
碳水化合物是細胞生長主要能量來源，其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。
無機鹽
培養(yǎng)液中無機鹽的主要功能是幫助細胞維持滲透壓平衡。此外，通過提供鈉，鉀和鈣 離子，幫助細胞調(diào)節(jié)細胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個非常重要的因素, 細胞通常可耐 受 260mosm/kg −320 mosm/kg。標準培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動。特別注意：向培 養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強酸或強堿中的物 質(zhì)。向培養(yǎng)液中添加 hepes 時需按以下方法調(diào)節(jié)鈉離子濃度。
緩沖系統(tǒng)
大多數(shù)細胞所需 ph 在 7.2 - 7.4。但是，細胞培養(yǎng)zui適 ph 值隨培養(yǎng)的細胞種類不同而 不同。成纖維細胞喜歡較高 ph (7.4 - 7.7), 而傳代轉(zhuǎn)化細胞系則需要偏酸 ph (7.0 - 7.4)。 由于多數(shù)培養(yǎng)液靠*（nahco3）與 co2 體系進行緩沖，因此，氣相中的 co2 濃度 應與培養(yǎng)液中*濃度相平衡。如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中 co2 濃度設(shè)定在 5％，培養(yǎng)液中 nahco3 的加入量為 1.97g/l；如果 co2 濃度維持在 10％，培養(yǎng)液中 nahco3 的加入量為 3.95g/l。細胞培養(yǎng)瓶蓋不應擰得太緊，以保證氣體交換。
hepes 是一種非離子緩沖液，在 ph 7.2 - 7.4 范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力，但是非 常昂貴，在高濃度時對一些細胞可能有毒。hepes 緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/l） 共用，以抵消因額外加入 hepes 引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細胞培養(yǎng)瓶的 蓋子應擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作 為 ph 指示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，堿性培養(yǎng)液呈深紅色。
維生素
在細胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來源， 但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以 適合更多的細胞系生長。
其它成分
在一些較為復雜的培養(yǎng)液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術(shù)中常用的 dmem 培 養(yǎng)液，使用時還需要補加丙酮酸鈉和 2-巰基乙醇（2-mercaptoethanol，2-me）。2-me 對細 胞生長有很重要的作用。有人認為它相當于胎牛血清，有直接刺激細胞增殖作用。2-me 的活性部分是硫氫基，其中一個重要作用是使血清中含硫的化合物還原成*，能誘 導細胞的增殖，為非特異性的激活作用。同時避免過氧化物對培養(yǎng)細胞的損害。另一個重 要作用是促進分裂原的反應和 dna 合成，增加植物凝集素(pha)對淋巴細胞的轉(zhuǎn)化作用， 已廣泛應用于雜交瘤技術(shù)，另外，也開始用于一些難以培養(yǎng)的細胞。2-me 是一種小分子 還原劑，極易氧化。分子量為 78.13，純的 2-me 是一種無色有刺激味的液體，比重為1.110-1.120(do20)，常用終濃度為 5×10-5m。常配制成 0.1m 的儲存液，用時每升培養(yǎng)液 加 0.5ml。
液體培養(yǎng)基保存：
液體培養(yǎng)基應于 4℃冰箱避光保存，實驗前放入 37℃預熱。未加血清液體培養(yǎng)基有 效期為 12 個月。液體培養(yǎng)基中的 l-*會隨著儲存時間的延長而慢慢分解。如果 細胞生長不良，可以再添加適量 l-*。
干粉培養(yǎng)基保存：4℃冰箱避光保存，有效期 36 個月。
血清
細胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是zui常用的血清， 分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價格 昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清，如廠家能做到這一 點，新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛 中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質(zhì)，其質(zhì)量明顯不如前兩種。
血清的質(zhì)量，種類及使用的濃度都有可能影響細胞的生長，而不同批次的血清支持細 胞生長的能力也不同，尤其是對克隆細胞的生長，某些批次血清可能含有毒性或抑制細胞 生長的物質(zhì)。因此，在購買大量血清之前，必須對血清支持細胞生長能力進行檢測，然后再，然后大量購買質(zhì)量好的同一批號的血清，并注意以下幾點：
（1）需要*保存的血清必須儲存于-20℃ – 70℃ 低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時間切 勿超過 1 個月。由于血清結(jié)冰時體積會增加約 10％，因此，血清在凍入低溫冰箱前， 必須預留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶凍裂。
（2）一般廠商提供的血清為無菌，無需再過濾除菌。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物，則可將血清 加入培養(yǎng)液內(nèi)一起過濾，切勿直接過濾血清。
（3）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20℃ 至 -70℃ 低溫冰箱中的血清放入 4℃冰箱 中溶解 1 天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均 勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。切勿直接將血清從-20℃進入 37℃解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀。
（4）熱滅活是指 56℃, 30 分鐘加熱已*解凍的血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此 熱處理的目的是使血清中的補體成分（complement）滅活。除非必須，一般不建議作 此熱處理，因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，而且還會影響血清的質(zhì)量。補體 參與反應有：細胞毒作用, 平滑肌細胞收縮, 肥大細胞和血小板釋放組胺, 增強吞噬 作用, 促進淋巴細胞和巨噬細胞發(fā)生化學趨化和活化。
（5）切勿將血清在 37℃放置太久，否則血清會變得渾濁，同時血清中的有效成分會破會 而影響血清質(zhì)量。
（6）血清中的沉淀物 絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心 3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。
顯微鏡下“小黑點”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物 在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影 響細胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應立即停止使用，更換另一批號的血清。