rtca技術(shù)簡介
美國艾森生物公司（acea biosciences,inc. ）創(chuàng)建于2002年5月。公司致力于開發(fā)具有*水平的實時無標(biāo)記細(xì)胞功能分析系統(tǒng)等系列產(chǎn)品，以加速現(xiàn)代藥物開發(fā)和提高基礎(chǔ)生命科學(xué)研究水平。在無標(biāo)記生物檢測這個新穎的生物技術(shù)領(lǐng)域處于地位。
實時無標(biāo)記動態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)(rtca real time celi anaiysis)是艾森生物(acea biosciences)*的核心技術(shù)。該技術(shù)采用特殊工藝,將微電極列陣整合在細(xì)胞培養(yǎng)板的每個細(xì)胞生長孔底部，用以構(gòu)建實時、動態(tài)、定量跟蹤細(xì)胞形態(tài)和增殖分化改變的細(xì)胞阻抗檢測傳感系統(tǒng)。當(dāng)貼壁生長在微電極表面的細(xì)胞引起貼壁電極界面阻抗的改變時，這種改變與細(xì)胞的實時功能狀態(tài)改變呈相關(guān)性，通過實時動態(tài)的電極阻抗檢測可以獲得細(xì)胞生理功能相關(guān)的生物信息、包括細(xì)胞生長、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁等。
基本原理：
圖1. rtca技術(shù)原理
系統(tǒng)的核心是把微電子細(xì)胞傳感器芯片整合到表面適于細(xì)胞貼附與生長的細(xì)胞檢測板的底部或細(xì)胞浸潤遷移板的微孔膜。
微電極阻抗主要由點(diǎn)及周邊的離子環(huán)境決定，當(dāng)電場加在上面的時候可以測量到一個基線阻抗。細(xì)胞的有無以及貼壁程度的改變都會影響電極傳感器表面電子和離子的通過。沒有細(xì)胞時，檢測孔底部排列的微電極陣列的阻抗分布近似均勻；加入細(xì)胞后，細(xì)胞會和電極表面接觸粘附，影響電極和溶液間的離子環(huán)境，導(dǎo)致阻抗的升高，細(xì)胞越多阻抗增加越多。
此外，細(xì)胞與電極的相互作用也會影響電阻。細(xì)胞在上述表面上的貼壁或生長可引起各個電極陣列的電極結(jié)構(gòu)的阻抗變化。細(xì)胞的貼壁程度緊密與否也會使電阻抗發(fā)生變化。
因此，粘附在電極表面的的細(xì)胞越多，細(xì)胞指數(shù)越大。同樣的，細(xì)胞與電極表面粘附越緊密伸展，電阻抗增加越大。測量電極間阻抗可提供關(guān)于電極上細(xì)胞生物狀態(tài)的重要信息。當(dāng)細(xì)胞生物狀態(tài)發(fā)生變化時，系統(tǒng)可以實時并自動獲取其模擬電信號，并可以轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號以進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
因此，電阻抗即反映為細(xì)胞指數(shù)的值，在多種實驗中用于指示細(xì)胞生長、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁程度等一系列生理狀態(tài)。
細(xì)胞指數(shù)：
基于測得阻抗，細(xì)胞數(shù)目（更確切的說，活細(xì)胞數(shù)目，或貼附細(xì)胞數(shù)目）和細(xì)胞貼附狀態(tài)之間的互相依賴關(guān)系，可由測得的阻抗頻譜推得一種稱作無量綱的參數(shù)術(shù)語細(xì)胞指數(shù)(ci))的參數(shù)，以提供一種有用的指數(shù)定量和比較基于阻抗測量方法中細(xì)胞的狀態(tài)。
它有以下幾個特點(diǎn)：
• 基于測量到的電極阻抗值可自動獲取并提供相應(yīng)的細(xì)胞指數(shù)。
• 所得到的選定孔的細(xì)胞指數(shù)反映了：
1、當(dāng)不存在細(xì)胞或者細(xì)胞沒有很好貼壁在電極上，細(xì)胞指數(shù)為零。
2、在相同的生理條件下，貼附在此孔電極表面的細(xì)胞越多細(xì)胞指數(shù)越大。因此，細(xì)胞指數(shù)可以用來定量檢測孔里存在的細(xì)胞數(shù)量。
3、此外，細(xì)胞狀態(tài)的變化，比如細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞貼附或者細(xì)胞生長都會導(dǎo)致細(xì)胞指數(shù)的變化。
技術(shù)優(yōu)勢：
新穎的電子傳感芯片設(shè)計，*的數(shù)據(jù)獲取和分析方法，以及的儀器設(shè)計配合使艾森能夠給細(xì)胞基礎(chǔ)分析提供一整套的分析平臺。這種平臺產(chǎn)品能成為細(xì)胞和分子生物實驗室的標(biāo)準(zhǔn)項目，也組成了新的生命科學(xué)實驗室器具的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。
艾森平臺技術(shù)對傳統(tǒng)的生物試驗檢測途徑的主要優(yōu)點(diǎn)包括：
• 高信息量：可連續(xù)檢測生物反應(yīng)的全過程，提供大量重要的動態(tài)反應(yīng)信息。
• 無標(biāo)記：分析無需昂貴的標(biāo)記或報告。
• 無創(chuàng)傷：電子檢測不會干擾細(xì)胞生長和分析。
• 高準(zhǔn)確度和精確度：定量衡量細(xì)胞生長，提供高于2個數(shù)量級的動態(tài)范圍，孔對孔cv通常低于10％。
• 自動實時檢測：整個實驗過程自動收集數(shù)據(jù)，實時分析，大大改善僅僅在終點(diǎn)分析的結(jié)果。
• 靈活性：*的設(shè)計允許自定義分析項目，提高實驗室的效率。
• 易操作：用戶友好的軟件，簡單直接的安裝，簡化培訓(xùn)和操作。
• 系統(tǒng)整合：微孔感應(yīng)設(shè)備可與已有的滴定板設(shè)備配套使用。
• 活細(xì)胞品質(zhì)控制：在培養(yǎng)孔中檢測細(xì)胞質(zhì)量。
應(yīng)用平臺：
實時細(xì)胞檢測平臺
利用實時細(xì)胞檢測平臺我們完成了6種藥物篩選模型，分別是細(xì)胞增殖/毒性篩選模型、egfr/rtk抑制劑篩選模型、g蛋白偶聯(lián)受體（gpcr）相關(guān)藥物篩選模型、細(xì)胞粘附相關(guān)藥物篩選模型、變態(tài)反應(yīng)性疾病相關(guān)藥物篩選模型、nk細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒篩選模型。該技術(shù)不僅可以實時監(jiān)測細(xì)胞的生長狀況，還可以預(yù)測藥物作用的某些可能機(jī)制（如圖2所示），關(guān)于特征性生長曲線和藥物作用靶點(diǎn)的聯(lián)系的相關(guān)文章已經(jīng)發(fā)表在cell系列的子刊“chemistry & biology”上，應(yīng)用這一技術(shù)可以實現(xiàn)一次篩選可找到針對不同靶點(diǎn)的候選化合物，大大縮減了篩選所需時間，起到“一石數(shù)鳥”的作用。本中心利用這一核心技術(shù)對12萬化合物進(jìn)行的篩選及后續(xù)確證實驗后得到的50個候選化合物，其中一個國家1.1類小分子化合物藥物已經(jīng)馬上要進(jìn)入ii期臨床，兩個候選化合物正在進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和臨床前的研究工作，另外還有4個致dna損傷、2個肝細(xì)胞生長因子抑制劑（hgfi）及2個抗有絲分裂的損傷候選化合物已經(jīng)基本完成細(xì)胞水平的實驗，準(zhǔn)備進(jìn)入動物實驗評價療效的階段。
圖2. 不同作用機(jī)制的抗腫瘤藥物在a549細(xì)胞上的特征性曲線
如圖2所示為一連續(xù)觀察了68小時的細(xì)胞生長狀態(tài)的曲線，對照組的a549細(xì)胞ci值隨著時間的增長而不斷升高，而加了藥物的細(xì)胞ci值與對照相比均有下降，但是下降的幅度及形態(tài)各不相同，提示藥物導(dǎo)致細(xì)胞毒性作用的機(jī)制不同。
compound a：抗有絲分裂藥物；compound b：致dna損傷藥物；compound c：細(xì)胞周期阻滯藥物；compound d：影響細(xì)胞骨架蛋白的藥物。
實時心臟功能檢測平臺
利用實時心臟功能檢測平臺，我們可以高通量的實時無標(biāo)記監(jiān)測心臟細(xì)胞活性和qt延長。該系統(tǒng)將同時監(jiān)測心肌細(xì)胞的搏動頻率、動作電位變化、qt間期監(jiān)測等，全面檢測化合物或藥物對心肌細(xì)胞的影響，準(zhǔn)確預(yù)測藥物的心臟毒性作用，為高通量心臟毒性評價成為可能，創(chuàng)新性的解決了技術(shù)難題。我們已經(jīng)研究建立人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞篩選模型和小鼠原代心肌細(xì)胞篩選模型，根據(jù)不同作用機(jī)制的心臟毒性藥物建立了特征曲線數(shù)據(jù)庫，并已經(jīng)開展了一系列新的化合物毒性篩選和心臟毒性評價，將為提高藥物研發(fā)的成功率，節(jié)約藥物研發(fā)的成本提供良好的支持。
圖3. 采用rtca心臟檢測系統(tǒng)實時動態(tài)監(jiān)測和記錄誘導(dǎo)分化心肌干細(xì)胞活性和收縮特性
如圖3所示，多能干細(xì)胞接種以后可以看到隨著時間的推移，ci值不斷增高，到60小時后進(jìn)入平臺期，說明誘導(dǎo)分化的心臟細(xì)胞接近成熟期，從功能檢測上可以看到心肌細(xì)胞收縮和跳動頻率的變化。
實時細(xì)胞遷移和侵襲技術(shù)平臺
實時細(xì)胞遷移和侵襲技術(shù)平臺是巧妙的結(jié)合了我們的核心技術(shù)和boyden小室的技術(shù)，精心的設(shè)計將細(xì)胞芯片放置在上室的背面以達(dá)到連續(xù)監(jiān)測細(xì)胞遷移和侵襲過程的目地。該方法避免了標(biāo)記對于細(xì)胞遷移的影響，并且不需要再通過計數(shù)或熒光方法來獲得細(xì)胞遷移率的變化，極大的簡化了實驗過程，使利用這一技術(shù)我們可以篩選影響細(xì)胞遷移及侵襲的特性的化合物成為可能。如圖4所示，是抗腫瘤藥物doxycycline影響細(xì)胞遷移的曲線。
圖4. 應(yīng)用實時細(xì)胞遷移技術(shù)監(jiān)測doxycycline對hela細(xì)胞遷移的抑制作用
如圖4所示，隨著doxycycline濃度由低到高，hela細(xì)胞的遷移能力明顯下降，右圖所示是根據(jù)曲線所作的作用后18小時的抑制細(xì)胞遷移的ic50。由于實驗過程是實時監(jiān)測，可以統(tǒng)計過程中任一時間點(diǎn)的ic50，獲得更完整的實驗數(shù)據(jù)。
全自動高通量篩選平臺
全自動高通量篩選平臺，對于大規(guī)模的化合物庫的篩選，為了提高檢測通量，避免人為操作的誤差，我們進(jìn)一步完善我們原有的hst系統(tǒng)，和beckman公司合作開發(fā)全自動384孔板高通量篩選系統(tǒng)用于篩選。這一系統(tǒng)的成功研發(fā)將極大提高我們的藥物篩選，特別是gpcr相關(guān)藥物篩選的能力。
圖5. 全自動高通量系統(tǒng)監(jiān)測組胺對hela細(xì)胞的作用
如圖5所示，表達(dá)人組胺受體的hela細(xì)胞接種在384孔板中（圖5a）,并用組胺刺激。組胺誘導(dǎo)產(chǎn)生了一個與肌動蛋白細(xì)胞骨架重排相關(guān)的瞬時的細(xì)胞信號（圖5b）。對組胺濃度取對數(shù)與大細(xì)胞反應(yīng)做圖，就產(chǎn)生了一個ec50值的劑量應(yīng)答曲線（圖5c）。384孔板的z factor值可以達(dá)到0.65。
rtca技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域：
新藥開發(fā)
• 抗腫瘤藥物篩選和研制
• 抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選和研究
• 抗腫瘤藥物療效觀察
• g-蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)疾病藥物的篩選和研究
• 藥物毒理學(xué)分析
• 現(xiàn)代中藥的開發(fā)和藥理機(jī)制分析
• 基因診斷及藥物療效的基因?qū)W分析
基礎(chǔ)應(yīng)用科學(xué)
• 細(xì)胞生長、分裂和死亡的機(jī)制研究
• 細(xì)胞生長、分化微環(huán)境研究
• 細(xì)胞表面受體配體結(jié)合研究
• 細(xì)胞生長因子的生物學(xué)功能研究
• 基因功能研究